Quimica Biologica TP N 1 Tecnicas Cromatograficas

Trabajo Práctico Nº 1:
Técnicas Cromatográficas

Objetivo:
Separar una mezcla de citocromo-c, dinitrofenil-glicina (DNP-glicina) y azul dextrán por cromatografía deintercambio iónico seguida de exclusión molecular.

Materiales y métodos:
Ver “Guía de Trabajos Prácticos de Química Biológica 2013”, págs. 21 – 24

Resultados:

Elución en columna deCM-celulosa con buffer B










Elución en columna de Sephadex G-50 con buffer A

*El punto de mayor absorvancia del azul dextrán se encuentra entre las fracciones 3 y 4,por lo que se utilizó un valor intermedio para el cálculo de Ve AD

Vr= 0.52 ml/f
Vt= 3.24 ml
Ve AD= 0.52 ml/f * 3.5 f= 1.82 ml
Ve DNP= 0.52 ml/f * 8 f= 4.16 ml
Kav DNP= (4.16 -1.82) ml / (3.24 – 1.82) ml = 1.65

Análisis de resultados
Se realizó una cromatografía de intercambio iónico en columna de CM-celulosa con buffer A, separando el citocromo-cde la muestra. El gel de CM-celulosa posee grupos COO-, por lo cual las moléculas de citocromo-c (con densidad de carga positiva) quedan retenidas en la columna, mientras que elazul dextrán y DNP-glicina eluyen por tener densidad de carga negativa.
Posteriormente se realizo una cromatografía por exclusión molecular en columna de Sephadex G-50 conbuffer A, logrando separar el azul dextrán de la DNP-glicina. El azul dextrán (PM > 500 kDa) eluye primero por poseer un tamaño mayor que la DNP-glicina (PM: 241 Da), mientras que laDNP-glicina queda parcialmente retenida en los poros del gel.
Luego de la separación de los componentes de la muestra, se calculo el Kav de la DNP-glicina observándose unvalor mayor a 1 (Kav DNP= 1.65). Esto se debe a fenómenos de adsorción adicionales que retardan la elución de la muestra debido al anillo aromático de las moléculas de DNP-glicina.