Quimica de alimentos

EXPERIMENTACIÓN EN QUÍMICA ANALÍTICA . 4º Curso de Licenciatura en Química

PRÁCTICA 4
DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE GLUCOSA Y SACAROSA EN ALIMENTOS 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA. Desde un punto de vista analítico, la capacidad de los enzimas para catalizar reacciones específicas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentes aplicaciones en diversos campos del análisiscomo análisis clínicos, análisis de productos alimentarios, análisis de preparados farmacéuticos etc. El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en: 1. La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posible determinar específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de separar. Para la cuantificación de sustratos sepueden utilizar dos métodos generales: a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de métodos (los más utilizados en la práctica) se permite que la reacción enzimática se complete o llegue al equilibrio y se mide la variación producida en la concentración de un producto de reacción o de un reactivo presente inicialmente en exceso. b. Métodos cinéticos, en los que seutilizan medidas de la velocidad inicial de la reacción enzimática para deducir la concentración inicial de sustrato. Los procedimientos de medida son idénticos a los utilizados para reacciones catalíticas en general. 2. Determinación de los mismos enzimas mediante el empleo de métodos cinéticos en los que se mide la velocidad de desaparición del sustrato o de generación del producto, relacionadacon la concentración de enzima en disolución. 3. Determinación de otras sustancias mediante el empleo de reactivos marcados con enzimas: enzimoinmunoanálisis. El objetivo de esta práctica es determinar el contenido de glucosa y sacarosa en un zumo empleando para ello un método enzimático espectrofotométrico de tiempo fijo. Se trata de certificar la autenticidad de un zumo de fruta comercial. Elvolumen de un

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zumo natural puede aumentarse simplemente agregándole agua. Otras formas más sofisticadas de adulteración incluyen la adición de azúcares y ácidos para producir disoluciones con composición similar a la del producto auténtico. En cualquier caso se altera la relación específica de azúcares con respectoa la del producto natural. En el anexo se facilita una tabla en la que se resumen los requerimientos de calidad para jugos según la organización AIJN (Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits an Vegetables ). 2. FUNDAMENTOS Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otrosmonosacáridos. Tanto en análisis clínicos como en la industria alimentaria se utilizan métodos enzimáticos para la determinación de glucosa. Así la glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a β-Dgluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable.
GOD

C6H12O6

+ O2

C6H10O6 + H2O2

Esta reacción en la que seconsume oxígeno podría seguirse manométricamente o mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que elimina elperóxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción:
HRP

H2O2 + Aceptor de oxígeno (DH2)

Producto coloreado

+ H2O

(D)

Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de aceptores...