Quimica industrial

CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS EN ETANOL POR ESPECTROSCOPÍA UV-VIS

Carla José y Laura Briand Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias Aplicadas-Dr. Jorge J. Ronco. Universidad Nacional de La Plata, CONICET, CCT La Plata. Calle 47 No 257, B1900AJK La Plata, Buenos Aires, Argentina. carlajose@quimica.unlp.edu.ar

INTRODUCCIÓN La cuantificación de proteínas en solución -en forma exacta,precisa y reproducible- es probablemente uno de los problemas experimentales más frecuentes que enfrenta el investigador. Existe una amplia gama de métodos para estimar la concentración proteica de una muestra debido al desarrollo de la proteómica en los últimos años, pero pocos de ellos se encuentran disponibles. El principio de los métodos químicos empleados para la determinación de laconcentración proteica es establecer una relación entre la cantidad de un producto (usualmente un cromóforo o un fluoróforo) formado por la reacción o interacción entre un reactivo y una función química proteica. El método de referencia para determinar químicamente la concentración proteica es la reacción de ninhidrina (1). Dentro de las alternativas a la reacción de la ninhidrina se encuentran los métodos deLowry y del ácido bicinconínico y métodos basados en la interacción de las proteínas con colorantes (método de Bradford y de colorantes aniónicos). Así mismo, los métodos gravimétricos se basan en la determinación directa de la masa de proteínas deshidratadas y en la preparación de soluciones valoradas mediante pesada del componente proteico. El método espectroscópico basado en la espectroscopiade absorción UV ha probado ser sensible, muy versátil, con un error aceptable y susceptible de ser usado en un laboratorio medianamente especializado. Permite obtener valores con una exactitud del 10 % o mejor y una precisión del 1-2 % (2). En este contexto, y teniendo en cuenta que nuestro interés es la cuantificación de proteína desorbida desde un biocatalizador en medio orgánico (etanol), locual agrega una complicación dado que los métodos mencionados anteriormente se basan en aplicaciones en sistemas acuosos, decidimos emplear la absorción UV-Visible para nuestros estudios. EXPERIMENTAL Materiales. En el presente trabajo se utilizaron seroalbúmina bovina (BSA) sólida (Sigma 99 %), muestra líquida de enzima CALB L (lipozyme batch LCN02102) provista por Novozymes Brasil, etanol absoluto(Carlo Erba 99,8 %) y cubetas plásticas UVette® 220-1600 nm con camino óptico 1cm. Absorción UV-Visible de la lipasa B de Candida antarctica y Seroalbúmina bovina. Se obtuvieron espectros UV-Visible de soluciones de diferente concentración de las proteínas en agua destilada y etanol, tales medidas se realizaron en el momento inmediatamente posterior a la preparación de las soluciones y luego de24 horas. En todos los casos se utilizó un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda35 y todas las soluciones se prepararon por duplicado. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las Figuras 1A y B muestran los espectros UV-Vis de las soluciones de la lipasa CALB y seroalbúmina bovina en agua destilada. El máximo de absorción para BSA se localiza en los 280 nm, mientras que para CALB se observa un corrimiento delmáximo hacia menores longitudes de onda (255-256 nm).

1,0

1,2

BSA en agua destilada
279

CALB en agua destilada
1,0
0,8

ABSORBANCIA (u.a.)

0,8

ABSORBANCIA (u.a.)

256

0,6

0,6

0,4

0,4

0,2

A

0,2

0,0
0,0

B
240 260 280 300 320 340 360 380 400
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

220

LONG ITUDDE ONDA(nm )

LONGITUD DE ONDA(nm)

Figura 1.Espectros UV-Visible de soluciones de CALB (A) y BSA (B) en agua destilada. Rango de concentraciones para CALB/AD: 0,0341 a 0,2043 mg/ml. Rango de concentraciones para BSA/AD: 0,16 a 0,95 mg/ml.

Los espectros de estas mismas proteínas en etanol son semejantes a los obtenidos en agua destilada en cuanto a que se mantienen las localizaciones de los máximos de absorción como puede observarse...