quimica

Practica 6. DETERMINACION DE LINFOCITOS T Y B
INTRODUCCION
Los linfocitos son las células centrales del aparato inmunocompetente. En la etapa embrionaria se originan en saco vitelino, hígado y bazo; más adelante, solamente en médula ósea, de donde migran y colonizan otros órganos. Los que llegan al timo, por influencia hormonal, se diferencian funcionalmente en una población llamadalinfocitos T, capaces de llevar acabo funciones conocidas genéricamente como respuesta inmunológica celular. Existe otra población, que para su diferenciación no requiere del timo; en las aves esta diferenciación se lleva acabo en la bolsa de Fabricio, órgano que no existe en los mamíferos y cuyo equivalente funcional es la medula ósea. A esta población corresponde los linfocitos B, que son los precursoresde las células formadoras de anticuerpos, mediadores de la inmunidad humoral.
Ambas poblaciones de linfocitos colonizan a los llamados órganos linfoides periféricos (nódulos linfáticos, bazo, amígdala, apéndice, y tejido linfoide asociado a mucosa), donde ocupan áreas definidas. Tanto los linfocitos T como los B, no permanecen indefinidamente dentro de estos órganos, si no que pueden migrarutilizando tanto la circulación sanguínea periférica como la linfática.
Morfológicamente los linfocito T y B, son indiferenciables entre si, sin embargo en su membrana celular poseen diferentes moléculas, algunas de las cuales son exclusivas de una u otra población (marcadores). Esto ha permitido diseñar métodos que permiten distinguir, enumerar y purificar poblaciones celulares.
A las moléculasantes citada, se les conoce genéricamente como CD (del Inglescluster of differentiation, o grupos de diferenciación). Con el uso de los anticuerpos monoclonales es posible identificar una enorme variedad de CD; por ejemplo, CD3, CD4, CD8 y CD19, que identifican a los linfocitos T totales, T cooperadores, T citotóxicos y linfocitos B, respectivamente.
En la inmunofluorescencia introducida porCoons en 1941, células y tejidos a los que se han unido anticuerpos específicos marcados con un fluorocromo, se irradian con luz ultravioleta para producir una excitación en los electrones no conjugados que brincan a niveles energéticos mayores, los que al regresar a su nivel original liberan la energía absorbida, en forma de luz visible.
Existen diferente fluorocromos, los más usuales son lafluorosceina y la rodamina que emiten luz de tonalidad verde y roja respectivamente.
La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta. En la directa, el anticuerpo especifico para el antígeno lleva unido el fluorocromo; en la indirecta el anticuerpo que lleva unido el fluorocromoesta dirigido contra las cadenas pesadas del anticuerpo que reconoce específicamente al antígeno de superficie.OBJETIVO
Que el alumno determine la presencia de moléculas en la superficie de células linfoides útiles en la identificación de las distintas subpoblaciones celulares.
DETERMINACION DE LINFOCITOS T Y B POR EL METODO DE ROSETAS
Todos los linfocitos T humanos poseen un receptor para alguna sustancia presente en la membrana de los eritrocitos de carnero, de modo que si estos se agregan a unapoblación enriquecida o purificada de linfocitos, solamente los que sean T quedaran recubiertos por los glóbulos rojos dando el aspecto de una roseta, que en esta caso se conoce como roseta E o roseta directa. Los linfocitos B también pueden formar rosetas siempre y cuando los glóbulos rojos estén recubiertos con anticuerpos y el subcomponente C3b del complemento (rosetas EAC o rosetas indirectas).
A.TITULACION DE HEMOLISINA A UNA DILUCION SUBAGLUTINANTE
Método
1.Lavar los eritrocitos de carnero por centrifugación con SS 3 veces a 1500 rpm durante 8 minutos y preparar al final 5 mL de una suspensión al 1% en SS.
2. Hacer una serie de diluciones dobles de la hemolisina hasta el tubo número 8, (dilución 1: 256), (volumen final de cada dilución = 0.25 mL). En un noveno tubo poner solo 0.25...