quimica




REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA


INTRODUCCIÓN
Este trabajo tiene como fin, el describir uno de los métodos de cuantificación de proteínas, análisis imprescindible para determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica, ya que es una técnica básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta.Existen varios métodos de cuantificación de proteínas, los cuales explotan alguna cualidad de las proteínas en el método de Biuret, este último en solución alcalina el ion Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color azúl-purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm), el rango de determinación del método es de 1 a 10 mg/mL. El método empleado en este trabajo,es el método de Lowry, el cual usa la reacción de Biuret entre el ion cobre (II) y el enlace peptídico, adicionalmente, se apoya de una segunda reacción oxido reducción entre los grupos OH de carácter reductor encontrados en los residuos de aminoácidos de tirosina y triptófano que, junto con los complejos Cu+2, reducen el reactivo de Folin-Ciocalteu (fosfomolibdato, fosfotungstato) generando uncolor azul, ambas reacciones generán una coloración azul, color que se lee a 750 nm. Las ventajas de añadir una segunda reacción al método de Biuret, es que el rango de determinación, cae de 1-10 mg/mL a 0,1-1 mg/mL, lo que genera en un menor pérdida de proteína tanto para la construcción de la curva estándar como para la medición de la proteína problema en sí. Sin embargo, está sujeto a muchasinterferencias, debido a que el reactivo de Folin-Ciocalteu tiene una reacción dependiente de la composición de la proteína.

Imagen 1. Complejo formado con ion Cu2+ y nitrógenos del enlace peptídico, a condiciones alcalinas para los métodos de Biuret y Lowry
JUSTIFICACIÓN:
El siguiente trabajo sigue como primicia que, si se realiza una curva patrón a base de una concentración de AlbúminaSérica Bovina (BSA) conocida, se puede determinar la concentración de una muestra problema. Por lo cual se persigue cubrir los siguientes puntos:
Comprender las características de una curva de calibración.
Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estándar a través de su construcción.
Determinar la concentración de proteína de una muestra problema con ayuda de la curva estándar.METODOLOGÍA
Se prepararon 45 mL de reactivo A con 15 mL de carbonato tartrato de cobre (CTC), 15 mL de dodecilsulfato de sodio al 10%, NaOH 0.8 N y agua. Un reactivo B se preparó diluyendo el reactivo de Folin-Ciocalteu en relación 1:5 con agua para dar un volumen total de 25 mL. Se usaron 10 tubos de ensayo y se añadieron los reactivos en el orden y cantidad indicados en la tabla 1.1; una vez agregadaslas distintas cantidades de muestra y reactivos se sometieron a homogeneización en vórtex. Posteriormente se incubarón a temperatura ambiente por 30 minutos. Se preparó el espectrofotómetro 15 minutos antes de ser usado, seleccionando una longitud de onda (λ) de 750 nm. Usando celdas de plástico se realizaron las mediciones, el primer tubo fungió como blanco, las lecturas fueron realizadas enorden creciente a la concentración de BSA y a través de estas se construyó una curva patrón, excluyendo de esta a la lectura 8, debido a que la anterior ya se encontraba en el límite de sensibilidad (siendo ligeramente superior a 0.8), además de tener una absorbancia inferior a la lectura 6 cuya concentración era menor, aplicando una regresión lineal, se obtuvo la ecuación de la recta, con la cualse interpolaron los valores de absorbancia de la muestra problema y se determinó su concentración.

RESULTADOS

Tabla 1.1 Reactivos y cantidades añadidas para la construcción de la curva patrón de BSA, necesaria para la determinación de la concentración de proteína BSA en las muestras problema.
Tubo
H2O (μL)
BSA(1 mg/mL) (μL)
Muestra problema
A (μL)
B (μL)
A (750 nm)
Proteína (μg)...