QUIMICA

Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida
Electroforesis de proteínas en geles de poli
acrilamida: Introducción y técnica básica
La electroforesis de proteínas en geles con una matriz
de poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en
poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es si
n duda alguna una de las técnicas más ampliamente usada paracaracterizar mezclas complejas de proteínas.
La electroforesis en poliacrilamida es un
método conveniente, rápido y económico a
nivel de muestra pues se requieren sólo canti
dades del orden de microgramos de proteína.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto
isoeléctrico y por eso tienen la propiedad
dedesplazarse cuando se someten a un cam
po eléctrico. La velocidad de migración es
proporcional a la relación entre
las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la
migración. Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los
electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta (
cargatotal/masa) entre proteínas. Este método se denomina
electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en
su
seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas. Una ventaja importante de los gel
es
de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes
y establesen un rango amplio
de pHs, temperatura y fuerza
iónica.
Algunas características destacables de la elect
roforesis en geles de poliacrilamida son:
a) Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización
de la acrilamida por acción de un agente entrecruzador ('cross-
linking'), la bis-acrilamida en presencia de
un iniciador y un catalizador. Como in
iciador se suele utili
zarTEMED (N,N,N,N'-
tetrametilnediamina) y como catalizador el ión persulfato (S
2
O
8
-
) que se añade en forma de pe
rsulfato amónico. En algunas
situaciones, como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electrofores
is se
emplean riboflavina y TEMED.
b) Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxí
geno es uninhibidor de la po
limerización. Además, durante la
polimerización se libera calor que podría provocar la
formación de burbujas en el seno del gel.
c) La velocidad de polimerización viene de
terminada por la concentración de persul
fato (catalizador) y TEMED (iniciador).
d) La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor el porocuanta
más bisacrilamida vs. acrilamida se use.
e) El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el
rango de separación del gel. Habitualmente los geles se denomin
an
en función del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. Así, la mayoría de las proteínas se separan bien en el rango de 5 a
10%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de grantamaño.
f) En función del estado de las proteínas (nativo o desnaturali
zado) a lo largo del proceso el
ectroforético éstas se clasifican
en
electroforesis nativas o desnaturalizantes:
1) una electroforesis desnaturalizante, la más común, es
la que somete a las proteínas a
migración asegurando la complet
a
desnaturalización (pérdida de la estructura
tridimensional). En estasituación la mi
gración es proporcional a la carga y al tam
año
de la molécula pero no a su forma. El agente desnaturalizante más empleado es el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.
2) una electroforesis nativa es
la que somete a las proteínas a migración
sin desnaturalización. En esta situación las
proteínas
migran en función de su carga, de su ta
maño y de su forma. Además se...