Quimica

Caracterización de proteínas.



Temario

Caracterización del tamaño molecular (masa/forma) o densidad de partícula. Difusión. Sedimentación.
Centrifugación. Ultracentrifugación. Gradientes. Ultracentrifugación a equilibrio de densidad (densidad de flotación) y por velocidad de sedimentación. Constante de Svedberg.
Electroforesis. Principios. Separación por carga/masa o pormasa. Importancia de la electroforesis como método de caracterización. Electroforesis en acetato de celulosa, poliacrilamida y poliacrilamida en presencia de SDS. Isoelectroenfoque. Electroforesis bidimensional.
Métodos cromatográficos. Principios. Cromatografía de exclusión molecular (gel filtración). Cromatografía de intercambio iónico. Cromatografía de interacción hidrofóbica. Cromatografíade afinidad. HPLC (cromatografía líquida de alta presión).
Desnaturalización y renaturalización. Diálisis.
Técnicas de determinación del peso molecular. Espectrometría de masa.




Bibliografía General


“Biochemistry” (Zubay, 4ta Ed.)
“Biochemistry” (Mathews y Van Holde, 2da Ed., 3rd Ed)
“Principios de Bioquímica” (Lehninger, 2nd Ed, 3rd Ed)
“Guide to protein purification: apractical approach” (Deustcher)
“Practical Biochemistry” (Wilson and Walker)
“Cálculos de Bioquímica” – Segel 2ª Ed.
“Physical Biochemistry” - Freifelder 2ª Ed.
“Practical Biochemistry” – Wilson and Walker 4th Ed.
“Instrumentos y técnicas de bioquímica”. T. Cooper






Problemas



Se tienen 5 proteínas distintas en una solución. Las proteínas se denominan P1, P2 hasta P5.Usando electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS se encontró que los pesos moleculares relativos respectivos son: 5000, 5400, 34000, 120000, 100000. Calculando los pesos moleculares relativos por sedimentación nativa se encuentra que son: 5000, 5400, 68000, 120000 y 500000. A la solución conteniendo estas proteínas se la somete a cromatografía de exclusión molecular que tiene un rango deexclusión entre 30000-130000.
a. Dibuje el perfil de elusión encontrado para esta columna.
b. Dibuje el perfile de elusión si las proteínas se encuentran en una solución que contiene i. urea, ii. β-mercaptoetanol iii. Cloruro de guanidinio
c. Esquematice en un gráfico ln (PM) vs. Vol de elusión.


2. ¿Cómo explican el efecto desnaturalizante sobre las proteínas de a) solventes orgánicos, b) urea yc) detergentes? ¿Cómo se puede determinar si ha habido desnaturalización?

3. Se determinó el peso molecular (PM) de una proteína en distintas condiciones experimentales:

|Solvente utilizado |PM relativo obtenido |
|Buffer diluído |1 señal correspondiente a 200000 Daltons|
|Cloruro de guanidinio (GuHCl) 6M |1 señal de 100000 Da |
|GuHCl 6M + 2-mercaptoetanol 100 mM |2 señales de 75000 y 25000 Da |

El GuHCl es un agente caotrópico como la urea.
El mercaptoetanol es un agente reductor de puentes disulfuro, al igual que el ditiotreitol.¿Qué puede decir sobre la estructura cuaternaria de esta proteína?


4. Se realizó una electroforesis en un gel de poliacrilamida a pH 8.0 y en presencia de SDS, para determinar el peso molecular (PM) de una proteína X. En la corrida se incluyeron proteínas de PM conocido (patrones). Los resultados obtenidos fueron:

|Proteína |Distancia recorrida (cm) |PM (Da)|
|Albúmina sérica |3.0 |68.000 |
|Quimotripsina |4.7 |23.000 |
|Citocromo C |5.7 |12.000 |
|Proteína X |4.1 |? |

a. Dibuje el resultado de la electroforesis indicando la posición de las...