Radioactivodad



PRÁCTICAS DE MÉTODOSIII RADIOACTIVIDAD







DETERMINACIÓN DE c AMP MEDIANTE RADIOINMUNOENSAYO (RIA)


INTRODUCCIÓN

El objetivo de la práctica es determinar la concentración de de un ligando determinado ( en nuestro caso el AMPc ), mediante la unión reversible a una proteína específica.

La técnica RIA utiliza complejos anticuerpo-antígeno (inmunocomplejo) como medio paragenerar un resultado perceptible, y donde se usa como marca medible un radioisótopo. Lo que se quiere medir puede ser tanto el anticuerpo como el analíto. Y la proteína específica es un anticuerpo (inmunoglobulinas anti AMPc).
Esta técnica se comenzó a practicar en los 60. Y es utilizada en la actualidad para la detección muy baja de analito.

Los anticuerpos poseen una alta especificidad yafinidad para un antígeno específico, nuestro analito. Los anticuerpos (Ab) son un tipo de proteínas denominado inmunoglobulinas. La más común es la inmunoglobulina G (IgG).
IgG es una proteína compuesta por dos regiones principales, estructural y funcional:
Región Fab: Contiene el punto de unión del antígeno (Ag) que varía entre diferentes anticuerpos.
Región Fc: Región de estructura constantedentro de una clase de anticuerpo.

Los reactivos para anticuerpos se generan en animales; antisuero. Este antisuero contiene una mezcla de anticuerpos que pueden unirse a un punto de unión o a diferentes puntos de unión del antígeno ( anticuerpos monoclonales y policlonales ). Los monoclonales son muy específicos.

Nuestro inmunoensayo es detipo competitivo, es decir, medimos la capacidad de competir del AMPc ( sin marcar ) y el [3H] AMPc por la proteína de unión específica.
Por lo que el hecho de que se mida menos radioactividad significa que hay más AMPc marcado en la muestra. La cantidad del complejo proteína-[3H] AMPc que se forme mantendrá una relación inversa con la cantidad de AMPc sin marcar. Al ser de un solo paso compitenpor una cantidad limitada de anticuerpo. Los radioinmunoensayos de tipo heterogéneo requieren de la separación del complejo marcado y del AMPc marcado sobrante, por lo que emplearemos el carbón activo.



Este radioinmunoensayo debe de ser exacto; describe la cantidad de analito realmente presente, y preciso; proporciona ensayos reproducibles. Es decir, la prueba es sensible y específica.Además es necesario la realización de una recta patrón ( calibración ) que son soluciones que establecen la correlación entre ciertos valores de la señal producida para una concentración de analito conocida. Es muy importante llevar a cabo bien este proceso porque en base al mismo llevaremos a cabo la determinación de la concentración de analito en nuestra muestra problema, que debe de encontrarsedentro del rango de concentraciones.
Otro detalle a tener en cuenta es que la matriz o solvente en la calibración sea idéntica ( a poder ser ) o similar, para que la respuesta de las señales de calibrado y de la muestra sean iguales.


MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción

Extracción simple. Las muestras se extraen por homogenizaión en un tampón que contiene EDTA ( es un poderoso agentequelatante y elimina iones metálicos del medio que pueden degradar la muestra) para prevenir la degradación del AMPc, y a continuación se calientan unos minutos en un baño de agua hirviendo para coagular las proteínas. En el sobrenadante tenemos el AMPc que lo recogemos por centrifugación y este será determinado.

Extracción con etanol. Nos da la ventaja de concentrar las muestras si la cantidadde AMPc presente es muy pequeña.

Reactivos

Tampón Tris-EDTA. Disolución 0,5M de EDTA a pH 7,5.
Proteína de unión.
[3H]-AMPc.
AMPc estándar.
Carbón adsorbente. Se mantiene en baño de hielo y agitación continua con imán magnético.







PROCEDIMIENTO

Preparamos la batería de tubos eppendorf y pipeteamos de la manera que se indica en la tabla siguiente :

TUBO
Tampón...