reacción en cadena de la polimerasa

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LICENCIADO EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
CURSO DE INGENIERÍA GENÉTICA

Nombre del estudiante: Grecia Arano García

Número
de lista

Fecha: 08/22/2013

1

RÚBRICA DE EVALUACIÓN
PUNTOS
FORMATO

10

FUNDAMENTO

15

MATERIALES Y EQUIPOS

10

PROCEDIMIENTO

20

RESULTADOS

20

RECOMENDACIONES YCONCLUSIONES

10

BIBLIOGRAFÍA

ACREDITADOS

10

OBJETIVO

PUNTOS

5

TOTAL

100

1

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LICENCIADO EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
CURSO DE INGENIERÍA GENÉTICA

Fecha
08/22/2013

TÍTULO DE LA PRÁCTICA
Elaborado por:
GRECIA ARANO GARCIA

Páginas
6

OBJETIVO
Extraer y purificar ADN genómico de la cepa de Pichiapastoris pPic α-Glu, KM71 usando la
técnica de TSNT.
FUNDAMENTO
La técnica de TSNT para el aislamiento de ADN involucra la lisis celular utilizando el buffer de
lisis TSNT (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100mM, Tris-HCl 10 mM y EDTA 1Mm pH=8)
para desestabilizar las membranas en el paquete celular y sea liberado el contenido interno de las
células (proteínas, ácidos nucleicos,carbohidratos y lípidos), el HCl presente en el buffer de lisis
TSNT ayuda a separar al ADN de carbohidratos y proteínas las cuales son precipitadas. Las
nucleasas son inactivas contra el ADN a bajas temperaturas por lo que el paquete celular debe
mantenerse frio, además que evita la desnaturalización de ácidos nucleicos.
La adición de fenol y el SEVAG (cloroformo-alcohol isoamílico) ayudan a laextracción del ADN
ya que el fenol-cloroformo tiene función desnaturalizante en proteínas, ayuda a la disociación de
proteínas con ácidos nucleicos, remueve lípidos y el cloroformo permite una mejor separación de
fases fenólica-acuosa al aplicarse fuerza centrífuga y el alcohol isoamílico disminuye las
emulsiones. La solución amortiguadora TE 1x tiene función de evitar la formación de oligómeros
deADN y ayuda a que el ADN no permanezca en la fase fenólica.
En la etapa final se agrega etanol a la fase acuosa recolectada ya que las moléculas de alcohol
impiden que los ácidos nucleicos interactúen con el agua, es decir el ADN, como el ARN son
insolubles en alcohol y hace que estos ácidos nucleicos precipiten formando una sustancia
blanquecina que puede apreciarse a simple vista. Loslavados con etanol remueven los restos de
reactivos utilizados en esta técnica, estos reactivos podrían interferir en reacciones como PCR. Se
resuspende en solución amortiguadora TE 1x para evitar la formación de oligómeros de ADN y se
almacena a 4°C para evitar que los ácidos nucleicos se desnaturalicen.
Para determinar la integridad de ADN en la muestra se realiza una prueba de electroforesis quese
basa en el principio de separar moléculas en un gel de agarosa según su carga eléctrica (dirección
hacia al ánodo o cátodo) y peso molecular/pares de bases (mientras más peso, menos movilidad o
distancia recorrida en el gel). Los ácidos nucleicos al tener carga negativa se dirigen hacia el polo
positivo o ánodo y se compara la distancia con un marcador de peso molecular y un control de ADNgenómico de la misma especie, si las distancias recorridas en el gel por el control y la muestra son
iguales y sin barrido esto quiere decir que se extrajo exitosamente el ADN.
La extracción de ADN es esencial para cualquier técnica de Ingeniería Genética posterior, como
transformación, clonación o expresión de genes, así como también es útil si se desea secuenciar el
genoma no registrado deun organismo nuevo y posteriormente analizarlo.
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LICENCIADO EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
CURSO DE INGENIERÍA GENÉTICA

MATERIALES Y EQUIPOS

Equipos
Agitador vortex
Autoclave
Campana bacteriológica
Juego de micropipetas
Congelador de -20°C
Refrigerador
Equipo para electroforesis
Materiales
Guantes desechables...