Reacción en cadena de la Polimerasa

Reacción en cadena de la Polimerasa
PCR, por sus siglas en inglés, “Polymerase Chain Reaction”. ¿Qué significa hacer una PCR?, esta se basa en hacer millones de copias a partir de pequeñas muestras de ADN, se basa en una técnica de amplificación de ADN.
¿Cuáles serían sus aplicaciones en medicina?
I. Para una carga viral, esto se relaciona con el control de la carga viral en pacientes con VIH,por ejemplo. Igual pasa con enfermedades infecciosas relacionadas con bacterias, virus, etc. En estos casos se utiliza la PCR en tiempo real.
II. Producción de Sondas
III. Detección de infecciones bacterianas y virales, la primera persona que comenzó hacer prueba de VPH fue una Doctora de “Monte España” y usó sondas de ADN junto con PCR.
IV. Diagnóstico de enfermedades hereditarias. Todas lasenfermedades que estudiamos anteriormente, poseen un método molecular para detectarlas.
V. Estudios de evolución molecular
VI. Estudios de medicina forense
VII. Estudios de filiación, para determinar la paternidad o maternidad de un producto.

¿Qué es el Master Mix1?
Es la mezcla reactiva que contiene los compuestos químicos necesarios para amplificar un segmento diana de ADN. Conste, no se amplificatodo el ADN, se amplifica una región en particular. Por ejemplo, se hace un examen de sangre, se extrae el ADN genómico y amplifico un segmento particular del ADN.
¿Qué contiene el Master Mix?
A. Agua libre de Nucleasas
B. Cloruro de Magnesio (MgCl2), porque este es un cofactor de las polimerasas
C. Desoxirribonucleótidos, si vas a amplificar, es obvio que necesitas muchos de estos.
D. Se necesitaun tampón (Buffer), porque tenes una enzima y necesitás que la enzima esté en un medio óptimo.
E. Se necesita una Polimerasa, una TAG polimerasa particularmente2
F. Se necesita el segmento diana de ADN que se quiere amplificar.
G. Se requiere de Primers, tanto Izquierdo como Derecho.
Todas las reacciones de PCR son idénticas a excepción de los “primers”, puesto que lo único que hace que unareacción de PCR sea específica para un segmento y no para otro, son los Primers.
Hay diferentes tipos de Polimerasa, catálogos enteros de esta, según como se quiera.
El amplicón, es el ADN diana que fue amplificado, ahora, ¿Cómo se selecciona nada más un pequeño fragmento de ADN de todo el genoma y lo amplifico? Agregando Primers a ambos lados de esos segmentos de ADN y como ya sabemos, los Primersson pequeñas secuencias de ADN complementario que “flanquean” la secuencia que se quiere amplificar. Por esto se le llama, Primer izquierdo y Primer derecho.
¿Cuáles son las características de los “primers”?
Un primer debe de tener una longitud de entre 18-24 bases.
La relación entre G:C debe de estar entre 40-60%.
La temperatura de fusión (Tm) debe de estar cercano a los 5°Celsius. Ejemplo: tengoun primer derecho e izquierdo, la temperatura de fusión de ambos primers, no debe exceder de 5° entre ellos, en otras palabras, que si la Tm de uno es de 70°, la temperatura del otro no debe de exceder de 75°, no puede tener más que eso, puesto que, no sería óptimo para la reacción.
La secuencia de los primers individuales debe iniciarse y terminarse con 1 o 2 bases purínicas.
Se debe evitarregiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas.
Evitar poli X.
Los primers meritan ser específicos y la especificidad se define como: “La capacidad para reconocer una secuencia única dentro del molde de ADN”. Esta especificidad depende de:
a. La longitud, entre más largo es un primer, menos específico se vuelve, o sea, es inversamente proporcional.
Una de las cosas que sedebe evitar en un primer, es que haya una “complementariedad intraprimer”, si esto ocurre, las bases del mismo Primer pueden formar enlaces complementarios, se pueden aparear entre ellas. Entonces como no es estático, puede ocurrir un apareamiento entre las cadenas Intracatenarias, o sea entre los primers.
En el diseño del primer se debe de evitar:
I. Apareamiento intra-primer


II. Apareamiento...