Reaccion de cadena polimerasa

Introducción
Los métodos de secuencia miento del ADN han permitido conocer la composición molecular de muchos sectores de cromosomas.
La secuenciación de los nucleótidos de un gen puede ser parcialmente deducida a partir de la secuencia de los aminoácidos de la proteína codificada.
Se han desarrollado métodos que permiten un rápido secuencia miento del ADN, lo que ha producido una verdaderarevolución en el mundo molecular. Gracias a ello se ha llegado a conocer la composición de numerosos genes humanos- nucleares y mitocondriales- y también la de extensos sectores no genéticos de los cromosomas. La investigación no ha descuidado el estudio del ADN de otras especies eucariotas, así como de diversas bacterias y virus.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR (Polymerase ChainReaction) fue inventada en el 19885 por el Dr. Kary Mullis, a quién se le otorgó el premio Nobel de Química en el 1992 por tal hazaña. Es una técnica de biología molecular, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de DNA particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento.
Esto nos permite amplificar la cantidad de DNA miles o millonesde veces.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Los métodos de secuencia miento se basan en la producción de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, que empiezan en un punto fijo y terminan en uno de los cuatro tipos de nucleótidos. Luego esos fragmentos se separan sobre la base de sus tamaños en un gel de poliacrimida del ADN de estudio.
La técnica de amplificación de ADN mediante lareacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico. Para llevar a cabo el experimento de amplificación es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora,...). Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismofragmento de ADN y, para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las células in vivo para replicar su ADN.
Componentes y optimización de la reacción de amplificación:
Muestra de ADN
Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en la reacción:
- Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo que queremos amplificar.
- Origen de lamuestra y proceso de extracción: la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentración de iones de Mg. en la disolución. Tampoco debe haber determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes... que inhibirían la actividad de la polimerasa.
- Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificación de ADN genómico de copia única se usancantidades de 100-500 ng. En el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng. El mínimo oscila entre 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.
Diseño de los cebadores
Para la elección de los primers, existen una serie de normas que nos pueden ayudar, aunque hay que indicar también que existen programas de ordenador que nos facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).
- El contenidoen G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relación máxima de purinas/pirimidinas será 60%/40%.
- Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base.
- No seleccionar cebadores que en su extremo 3´ tenga una importante estructura secundaria.
- Se recomienda que los extremos las últimas bases sean G o C.
DNA Polimerasa
Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo lareplicación del ADN, siguiendo el mismo método de síntesis. Se pueden clasificar en:
- Termolábiles: Tª óptima de 37-42ºC. Se desnaturalizan con el calor.
- Termoestables: Tª óptima de 74 ºC. Resiste durante 40-50´a 96ºC.
Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq-polimerasa. Es una enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas temperaturas. La...