Reaccion de la cadena de la polimerasa

Introducción:
PCR son las siglas en inglés de reacción en cadena de la polimerasa Polymerase Chain Reaction. Se trata de una técnica imprescindible en cualquier laboratorio de investigación, y se ha convertidio sin duda en la más famosa gracias a sus aplicaciones en medicina forense. Básicamente se trata de una serie de reacciones que acaban produciendo millones de copias de un fragmentoconcreto de ADN partiendo de una o unas pocas copias iniciales.La clonación génica mediante técnicas de ADN recombinante revolucionó la biología a principios de la década de los setenta, al permitir a los investigadores aislar y amplificar genes individuales para el análisis de su secuencia, expresión y regulación. Entre 1983 y 1986, Kary Mullis desarrolló una nueva técnica igualmente revolucionaria, quepermite realizar la amplificación in Vitro de muestras de ADN extraordinariamente pequeñas, sin necesidad de una transferencia previa a células vivas. Esta técnica, denominada PCR (del inglés reacción en cadena de la polimerasa) ha ampliado enormemente el poder de la investigación del ADN recombinante, incluso ha reemplazado a muchas de las técnicas anteriores. La PCR permite la amplificacióndirecta de fragmentos de ADN específicos sin clonación, y puede partirse de cantidades de ADN infinitesimalmente pequeñas; evitando el largo y tedioso trabajo de clonación y reclonación que requerían las primeras técnicas. Así, ha facilitado enormemente el análisis de los genes eucariotas, ya que evita parte de los problemas que comporta la clonación de DNA procedente de genomas muy grandes. Asímismo, ha encontrado numerosas aplicaciones en un amplio abanico de disciplinas.
Fundamento científico:
La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear estaregión doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleotidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar.
Instrumental e insumos:
Para realizar la técnica se necesitan:
• Desoxinucleotidos trifosfatos (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.
• Dos cebadores oprimers, oligonucleotidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
• Iones Divalentes. Se suele usar magnesio, agregado comúnmente comocloruro de magnesio, agregado comúnmente como cloruro de magnesio cation divalente. También se puede emplear Manganeso, para Mutagenesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.
• Iones monovalentes, como el Potasio.
• Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado parael funcionamiento de la ADN polimerasa.
• ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70ºC (la más común es la Taq polimerasa)
• ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
• Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Técnica operatoria:
Lareacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena
2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras
3ª Extensión del cebador por actuación de la ADN polimerasa
En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza...