REACCION DE LA POLIMERASA EN CADENA PCR

1. OBJETIVOS

Preparar y manipular una muestra de ADN
Replicar una muestra de ADN en un tubo de ensayo
Aprender el manejo del Termociclador MJ Mini®

2. FUNDAMENTO TEÓRICO
La reacción en cadena dela polimerasa es un método alternativo a la clonación del ADN para conseguir un gran numero de copias de un gen (secuencia diana) si conocemos la secuencia de nucleótidos que lo flanquean, sinprecisar de vectores de clonación.

Esta técnica esta basada en el dogma principal de la biología molecular, e imita in vitro, sin uso de células el ciclo de replicación del ADN que tiene lugar en unacelula antes de dividirse y lo repite entre 20 y 30 veces. Asi se obtiene un gran numero de copias de cualquier secuencia de ADN.

Para la realización de la PCR se añaden en un tubo los siguientescomponentes para cada ciclo de replicación, el cual consta tres etapas:

1. Desnaturalizacion. Calentamiento a 95ºC para separar las dos cadenas de ADN que se van a clonar.

2. Hibridacion. Enfriamiento a55ºC para promover que los cebadores hibriden con las secuencias complementarias correspondientes en cada una de las dos cadenas de ADN.
3. Sintesis de ADN. Calentamiento a72ºC para que la ADNpolimerasa sintetice en cada una de las dos cadenas de ADN

Para que la PCR transcurra eficientemente y se complete el ciclo de forma adecuada se necesitan varios componentes:
Añadir a la muestra de ADN
Losoligonucleótidos primers
La enzima (Taq DNA polimerasa)
Un buffer de reacción especial Master mix.
Este contiene todos los componentes para que la PCR se pueda llevar a cabo, incluidos lospaquetes de construcción de DNA, un buffer especial que mantenga un pH óptimo, sales y MgCl2.

Las sales y los iones magnesio conocidos como cofactores, son necesarios para que la Taq DNA polimerasa actúeópticamente. Es importante guardar el master mix frío antes de su uso, así que la enzima no empezará a trabajar antes de añadir el patrón de DNA.

Las aplicaciones de la PCR, debido a su capacidad de...