Reaccion De La Polimerasa

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) y otras técnicas moleculares en el estudio de afecciones dermatológicas
Noris Rodríguez
nmrodric@gmail.com

Miguel A. Barrios

Venezuela
Laboratorio de Ingeniería Genética, Instituto de Biomedicina, Universidad Central de Venezuela: Apdo. postal 4043, caracas 1010 A; Email: nmrodric@gmail.com. Telefax: 0212 8648624

Reacción en Cadena de laPolimerasa La Reacción en Cadena de la Polimerasa, conocida como P.C.R por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis que permite la síntesis “in Vitro” de secuencias específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) 1.

Fundamentos e Importancia La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotasrealizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN en sentido 5` 3`usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región de doble cadena, se utilizan los denominados iniciadores (primers ). Estos son una pareja de oligonucleótidos diseñados de tal manera que sean complementarios a cada uno de losextremos del fragmento de ADN que se quiere amplificar. Este proceso se lleva a cabo mediante ciclos alternados de temperaturas altas y bajas, que permiten separar las hebras de ADN formadas entre si tras cada fase de replicación y, la unión nuevamente de estas hebras con la polimerasa para que vuelvan a duplicarse. Todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador,el cual permite calentar y enfriar los tubos de reacción (efecto Peltier) controlando la temperatura necesaria para

cada etapa de la reacción. La automatización del proceso se debe al descubrimiento de la enzima Taq polimerasa termoestable, extraida del Thermus aquaticus2, que eliminó el inconveniente de agregar enzima fresca en cada paso de la reacción.

Fig 1.- Equipo (maquina de PCR),utilizado para la amplificación del ADN. La maquina se programa con las temperaturas necesarias para cada paso de la reacción y todo el proceso de amplificación se realiza automáticamente.

En la actualidad, la PCR es una técnica de rutina indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica con una gran variedad de aplicaciones. La clonación del ADN para la secuenciación, la filogeniabasada en el ADN, el análisis funcional de genes, el diagnostico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y prueba de paternidad), taxonomía, la detección y diagnostico de enfermedades infecciosas, son algunas de las aplicaciones donde la PCR ha sido implementada como una técnica de gran valor. Componentes de la PCR Desoxinucleótidostrifosfato (dNTPs). Es una mezcla de deoxi nucleótidos que sirve de sustrato para la síntesis de nuevo ADN.

Iniciadores (primers). Dos oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 10-30 nucleótidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben estar enfrentados (uno en cada hebra del ADN), paradelimitar el fragmento a amplificar). ADN polimerasa. El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa, una ADN polimerasa extraída de la bacteria termófila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80 °C), eliminó los grandes inconvenientes del método de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta después de la desnaturalización del ADNADN molde. Molécula que contiene la región de ADN que se va a amplificar. Etapas de la PCR La PCR consiste en una serie de cambios repetidos de temperatura llamados ciclos. Por lo general el número de ciclos es de 20 a 30, cada ciclo consiste en tres cambios de temperatura. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo, dependen de algunos parámetros en los que se incluye, la enzima...