Reaccion en cadena de la polimerasa

Diseño de Oligonucleótidos para PCR |
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  | Uno de los parámetros más importantes para tener éxito en la amplificación por PCR es el diseño de los oligonucleótidos cebadores (oligos o primers). Si éstos no están bien diseñados la PCR puede no funcionar bien; el resultado es la nula amplificación del producto debido a amplificación no específica o a la formación de dímeros deoligonucleótidos que pueden competir con la amplificación del producto deseado.¿Qué debemos tener en cuenta a la hora de diseñar oligonucleótidos para PCR?Las principales variables a tener en cuenta son: 1. Tamaño del oligonucleótido 2. Temperatura de fusión (Tm) 3. Especificidad 4. Secuencias complementarias 5. Contenido en G/C y tractos de polipirimidinas (T, C) or polipurinas (A, G) 6. Secuencia 3’terminal. 7. Secuencia 5’ terminal y regiones centrales 1. Tamaño del oligonucleótidoEl tamaño del oligonucleótido influye en la especificidad, en la temperatura de fusión y en el tiempo necesario para la hibridación del oligonucleótido a su secuencia complementaria, por tanto es decisivo para que salga bien la PCR. Los oligonucleótidos de 18 a 24 bases son muy específicos de secuencia, siempreque la temperatura de hibridación sea óptima.El tamaño del oligonucleótido es proporcional a la eficiencia de hibridación: en general, cuanto más largo sea el oligonucleótido más ineficiente será la hibridación. Si hay pocos moldes con su oligonucleótido hibridado (o anillado) en cada paso de la PCR el resultado va a ser muy poco producto amplificado.Los oligos no deberían ser demasiado cortos amenos que se especifique lo contrario en el protocolo. La meta es diseñar un oligonucleótido con una temperatura de hibridación (la que programamos en el termociclador) de al menos 50ºC.La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es muy importante en la PCR. Como regla general la temperatura de hibridación debe ser 5- 8°C más baja que la de fusión. Por tanto, si queremosun oligonucleótido con una temperatura de hibridación de al menos 50°C, correspondería a un oligonucleótido con una temperatura de fusión de (Tm ~ 55-58°C). A menudo, la temperatura de hibridación así determinada no es óptima y es necesario determinarla empíricamente. Se puede hacer fácilmente con un termociclador con gradiente (por ejemplo el  Mastercycler® gradient de Eppendorf).2. Temperatura defusión (Tm)Es importante tener en cuenta que en una reacción de PCR hay dos oligonucleótidos. Ambos oligonucleótidos deberían diseñarse de manera que tengan temperaturas de fusión  similares. Si los oligonucleótidos no tienen Tm parecidas, la amplificación será menos eficiente o incluso puede no funcionar ya que el oligonucleótido con la Tm más alta hibridará mal o inespecíficamente a bajastemperaturas mientras que el oligonucleótido con la Tm más baja puede que no funcione a temperaturas más altas.Las temperaturas de fusión de los oligos se calculan de una manera muy exacta con cálculos termodinámicos usando la siguiente fórmula:Tmoligonucleótido = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] –273.15°C + 16.6 log 10 [K+]donde H es la entalpía y S la entropía para la formación de la hélice, R es la constantemolar y c es la concentración del oligonucleótido. Pero lo más sencillo es usar cualquiera de los paquetes de software para el diseño de oligonucleótidos del mercado. Por suerte, una buena aproximación (generalmente válida para oligos en el rango de 18–24 bases) a la Tm se puede calcular con la fórmula:Tm = 2(A+T) + 4(G+C)  Fórmula de WallaceEn esta tabla hay valores de Tm de oligonucleótidos devarios tamaños usando la fórmula de Wallace asumiendo un contenido en G/C del 50%. Tamañodel Oligonucleótido | Tm = 2 (A+T) + 4(G+C) | Tamaño del  Oligonucleótido | Tm = 2 (A+T) + 4(G+C) |
4 | 12°C | 22 | 66°C |
6 | 18°C | 24 | 72°C |
8 | 24°C | 26 | 78°C |
10 | 30°C | 28 | 84°C |
12 | 36°C | 30 | 90°C |
14 | 42°C | 32 | 96°C |
16 | 48°C | 34 | 102°C |
18 | 54°C | 36 | 108°C |
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