Reaccion En CADenA De La Polimerasa

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MEDICINA
PRACTICA 4

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

Realización: 14 de abril del 2010

Entrega: 6 de mayo del 2010


PRÁCTICA 4
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
Introducción
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido uno de los avances más espectaculares que se han suscitado en los últimos años en el campo de labiología molecular. Anteriormente las reacciones se realizaban utilizando el fragmento Kienow de la ADN polimerasa I de E. coli, los resultados frecuentemente eran inadecuados, porque la temperatura a la que trabaja la enzima permite la extensión de secuencias que no son especificas para el oligonucleótido utilizado, además de ser necesaria la adición de enzima para cada ciclo de amplificación, ya quela enzima se inactiva a la temperatura de desnaturalización de DNA.
Sin embargo el descubrimiento de la ADN polimerasa de la bacteria termófila Thermus aquaticus (Taq polimerasa), permitió el perfeccionamiento de la técnica. Esta enzima puede resistir a temperaturas de 95°C necesarias para la separación de las dos hebras de ADN y permiten manejar temperaturas de alineamiento y amplificaciónque dejan margen para manejar la astringencia de la reacción y así acceder únicamente a las secuencias de ADN específicas para la sonda utilizada.
La amplificación de material genético hacen esta técnica útil para el diagnostico de enfermedades infecciosas y parasitarias, clonación de genes, generación de grandes cantidades de ADN para secuenciación, análisis de mutaciones, búsqueda de expresióndiferencial de genes, y muchas otras técnicas de manipulación de ADN y ARN.
La reacción se realiza básicamente cuando se mezclan el templado del ADN, dos iniciadores apropiados (primers) generalmente no mayores de 30 bases, la Taq polimerasa, dNTP’s y el buffer. Una vez mezclados se inician los ciclos, en los cuales se permite la desnaturalización del ADN, alineamiento de los iniciadores y lasíntesis exponencial de los productos amplificados.
Existen varias condiciones que deben ser estandarizadas para una óptima reacción de PCR como son:
* La concentración de MgCl2
* La pureza del templado de ADN
* La concentración de los dNTP’s
* Los tiempos de desnaturalización
* La determinación de la temperatura de alineamiento
La PCR se basa en el uso de la DNApolimerasa para copiar un molde de DNA en ciclos repetidos de replicación. La polimerasa es guiada hasta la secuencia de a ser copiada por cortos oligonucleótidos cebadores que son hibridados al molde de DNA al comienzo y al final de la secuencia de DNA deseada. Estos oligonucleótidos los diseña el investigador de modo que proporcionan un cebador para la replicación de DNA sobre cada cadena de la doblecadena de DNA original. Debido a que los cebadores tienen que sintetizarse químicamente la PCR puede utilizarse solo para clonar DNA con secuencias de comienzo y terminación conocida. Guiadas por estos cebadores las DNA polimerasas se emplean luego para producir muchas copias de la secuencia requerida. La PCR es extremadamente sensible; puede detectar una sola copia de una secuencia de DNA enuna muestra al amplificarla tanto que se torna detectable por, por ejemplo, su tinción luego de la separación mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida.
La poliacrilamida es corrientemente el medio de soporte más efectivo para la electroforesis de proteínas y pequeñas moléculas de RNA. El gel de poliacrilamida se prepara mediante la polimerización de acrilamida conN,N’-metilen-bis-acrilamida en un molde adecuado o ya en el recipiente en que se va a realizar la electroforesis. . La acrilamida permite discriminar diferencias más pequeñas en el tamaño de los fragmentos que la agarosa. El equipo que se utiliza en los geles de poliacrilamida consta de un equipo vertical que presenta dos reservorios separados para las soluciones de corrida, de un soporte para formar geles,...