reacciones de identificación

















Universidad de Vigo, Facultad de Biología
Guión de prácticas de la asignatura “Biología molecular”
Curso académico 2004-2005



PLAN DE TRABAJO

Día 1
Aislamiento de ácidos nucleicos a partir de células eucariotas 3
Inducción de la enzima beta-galactosidasa 5

Día 2
Transformación de bacterias 4
Inducción de la enzima beta-galactosidasa 5Día 3
Transformación de bacterias 4
Aislamiento de ácidos nucleicos a partir de células bacterianas 6

Día 4
Preparación de DNA plasmídico 7
Digestión de un plásmido con endonucleasas de restricción 8
Estimación de la concentración de DNA en disolución 9

Día 5
Electroforesis de DNA en gel de agarosa 10
Determinación colorimétrica de RNA 11



LA SEGURIDAD EN ELLABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR


Es recomendable que cada alumno lea atentamente esta página para realizar adecuadamente las prácticas.



El trabajo con Escherichia coli y los genes de resistencia a antibióticos.
Escherichia coli forma parte de la flora bacteriana del intestino grueso y raramente se asocia con enfermedades en individuos sanos. De todos modos podría existir preocupaciónacerca de la ingestión accidental de Escherichia coli, especialmente en el caso de bacterias que han sido transformadas con plásmidos. La investigación ha mostrado que las cepas de uso habitual en el laboratorio no tienen capacidad de crecimiento en el intestino ni pueden transferir DNA plasmídico a células de Escherichia coli residentes.
Las cepas de uso común en la investigación actual derivan deuna cepa de Escherichia coli denominada K-12, que fue aislada en su origen a partir de las heces de un paciente con difteria en la Universidad de Stanford (California, EE. UU) en 1922. Los trabajos de Edward Tatum durante los años 40 popularizaron su uso en estudios bioquímicos y genéticos. Investigaciones llevadas a cabo durante los años 70 mostraron que la cepa K-12 no puede colonizarefectivamente el aparato digestivo humano, probablemente a causa de los cambios genéticos acumulados durante décadas de cultivo in vitro.
El DNA plasmídico puede ser transferido de una célula de Escherichia coli a otra durante el proceso conocido como conjugación. El transporte requiere una proteína de movilidad (codificada por el gen plasmídico mob) y un sitio específico en el plásmido denominado nic. Laproteína mob produce una mella (enlace fosfoéster roto) en el sitio nic y se une a la cadena mellada para conducir al plásmido a través del canal de conjugación hasta la célula receptora. Los plásmidos que se utilizan en clonación molecular no poseen ni el gen mob ni el sitio nic y, por lo tanto, no pueden ser movilizados para su transporte.


Precauciones durante el cultivo bacteriano
Parallevar a cabo las prácticas de un modo adecuado es suficiente con seguir unas simples normas de manejo y limpieza del material:
1. No acercar la nariz o la boca a bocas de tubos o puntas de pipeta que contengan o hayan estado en contacto con el cultivo bacteriano.
2. Dispensar el cultivo bacteriano con pipeta y siempre con ayuda de una bomba de succión.
3. Desinfectar el material que haya estadoen contacto con bacterias. Los líquidos se vierten en un baño de agua con lejía. Los sólidos se depositan en una bolsa para autoclave. Esterilizar posteriormente a 121ºC durante 15 minutos y tratar como un residuo normal.
4. Lavarse las manos siempre al abandonar el laboratorio.

AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE CÉLULAS EUCARIOTAS

Introducción
Los ácidos nucleicos (DNA y RNA) deun tejido animal se extraen a partir de un homogeneizado de células. Este se obtiene por ruptura de las células en un tampón utilizando un homogeneizador. Las membranas lipídicas se convierten en solubles en presencia del detergente dodecil sulfato sódico (SDS), que también desnaturaliza las proteínas. Todas estas impurezas se eliminan extrayendo la mezcla acuosa resultante con varios compuestos...