Reacción Cadena Polimerasa

I. INTRODUCCIÓN

Reacción en cadena de la polimerasa (RCP), técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. La RCP puede utilizarse para identificar individuos a partir de cantidades mínimas de tejidos o sangre, para diagnosticar enfermedades genéticas y para investigar laevolución. La RCP fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en laCetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnicano se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo. La RCP opera en formade ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento en unas pocas horas. La técnica es sencilla y pueden utilizarla científicos sin demasiada formación en biología molecular. Los elementos necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de juego, y se utilizan en medios muy variados, desde la investigación forensehasta el diagnóstico clínico

II. REACCIÓN EN CADENA POLIMERASA

El método se basa en las características de la estructura química del DNA y su replicación semiconservativa. Es decir, de acuerdo con el modelo de Watson y Crick, el DNA es un polímero formado por dos cadenas complementarias (cadenas antiparalelas), constituido por unidades de desoxirribonucleótido de cuatro bases nitrogenadasadenina, guanina, citosina y timina unidas al azúcar desoxirribosa. La parte que no varía en la molécula del DNA consiste en la desoxirribosas unidas por grupos fosfato. Específicamente el hidroxilo 3’ del azúcar de un desoxirribonucleótido se une al hidroxilo 5’ del siguiente azúcar a través del puente fosfodiester. Para duplicarse, el DNA se separa en sus dos cadenas complementarias; así, cadauna de ellas sirve de molde o plantilla. Al final del proceso se obtendrán dos moléculas de DNA, cada una de ellas formada por una cadena original y una cadena complementaria que ha sido sintetizada “de novo” La enzima que realiza este proceso se denomina DNA polimerasa. Esta enzima añade los nucleótidos en el hidroxilo 3’ terminal de la cadena de DNA paterna. En otras palabras, se requiere unacadena con un grupo 3’ OH disponible, el cuál es el iniciador, para formar el enlace covalente fosfodiester 3’ – 5’. La reacción de alargamiento, catalizada por el DNA polimerasa, consiste en un ataque nucleofílico del átomo de fósforo del desoxirribonucleótido (dNTP) al 3’ OH del iniciador, para formar la unión covalente fosfodiester.

El aspecto más importante de la doble hélice de DNA es laespecificidad de apareamiento de las bases modelo de Watson y Crick, quienes dedujeron que la adenina debe aparearse con la timina, y la guanina con la citosina, debido a las uniones hidrógeno que se establecen entre las bases y a la restricción esférica que se produce.
Las dos cadenas de DNA se separan fácilmente cuando las uniones hidrogeno de las bases se rompen. Esto se realiza cuando unasolución de DNA es calentada entre 77 y 100°C. Las bases complementarias se reasocian espontáneamente para formar la doble hélice puede separarse y reasociarse es crucial para las funciones biológicas del DNA.
El método RCP (Reacción en cadena de la polimerasa) emplea ciclos repetidos de síntesis in vitro del DNA dirigida por un oligonucleótido iniciador. Las secuencias de los oligonucleótidosiniciadores se determinan en base a una parte conocida de la secuencia del DNA molde, ya que deben ser complementarias a cada una de las cadenas del DNA, dejando libres los lados opuestos para poder ser amplificados. Dichos oligonucleótidos sirven como iniciadores para la síntesis in vitro del DNA, la cual es catalizada por la enzima DNA polimerasa, y ellos también determinan los extremos del fragmento...