Reacion En Cadena De La Polimerasa

P.R.C Reacción en cadena de la polimerasa
Fundamento e Importancia
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse las hebras de ADN paraque vuelvan a duplicarlas. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la década de 1980.
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C enlas fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent)y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladoresmodernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin deevitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecían de este sistema, solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para unagran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Para realizar la técnica se necesitan:
• Los 4desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
• Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no muchadistancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
• Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentracionesde Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.
• Iones monovalentes, como el potasio.
• Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de el ADN polimerasa.
• ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).
• ADN molde,...