Recolección de adn

Estimación de las Frecuencias Alélicas del D16S539 en una Muestra
Poblacional de ascendencia andina ancashina. Tito Tadeo, Raúl Yhossef.
Derechos reservados conforme a Ley

MÉTODOS

Recolección de la muestra.-

La colección se realizó por extracción de sangre venosa mediante el sistema de vacío usando los
tubos vacutainer Venoject®II EDTA (K3) estériles. Los leucocitos y plaquetas seobtuvieron por
centrifugación, para lo cual los 5 ml de sangre total colectados en el tubo vacutainer fueron vertidos
en un tubo Falcon de 50 ml, a los que se le agregó 45 ml de buffer de hemólisis (0.155 M NH4Cl,
10mM KHCO3, EDTA pH 7.9, previamente autoclavada) y se agitó suavemente. Después de
incubar a 5°C durante 45 minutos se centrifugó a 3000 rpm por 25 minutos El sobrenadante
hemolisadofué descartado directamente, es decir colocando en posición invertida rápidamente el
tubo y vertiendo el hemolisado al recipiente con lejía; el precipitado de glóbulos blancos fue
congelado a – 20°C.

Extracción del DNA.-

Para purificar el DNA, se utilizó el método de cloroformo – alcohol isoamílico (Marmur, 1961),
para lo cual los precipitados de glóbulos blancos se resuspendieron en 1 mlde solución de lisis
celular (10 mM TrisHCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,5 % SDS) y se incubó a 50°C
por 24 horas (Strauss, 1994). A los glóbulos blancos lisados se agregó 4 ml de cloroformo:alcohol
isoamílico (24:1), se mezcló suavemente por 25 minutos y se centrifugó a 6500 rpm por 15 minutos
(Strauss, 1994). La fase superior acuosa se recuperó, y se le agrego 4 ml decloroformo:alcohol
isoamílico (24:1) hasta que no haya interfase. El DNA contenido en la fase acuosa se precipitó con
10 ml de etanol de 96° helado, mediante una pipeta Pasteur el DNA precipitado se colocó en un
tubo ependorff de 1.5 ml, luego se lavó dos veces con etanol de 70º helado y se secó el exceso de

Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y BibliotecaCentral UNMSM

Estimación de las Frecuencias Alélicas del D16S539 en una Muestra
Poblacional de ascendencia andina ancashina. Tito Tadeo, Raúl Yhossef.
Derechos reservados conforme a Ley

alcohol de las muestras evaporándolo en una estufa de 37°C. El DNA seco se resuspendió en 500
µl de buffer TE (10 mM TrisHCl pH 8.0, 1mM EDTA) y se colocó en un baño de temperatura a
37°C por 12 horas.Las muestras del DNA completamente resuspendidas se almacenaron a –
20°C.

Cuantificación del DNA.-

Cada solución de DNA fue diluida (1:10), en agua milliQ. A estas diluciones se les midió la
absorbancia en un espectrofotómetro (LKB), empleando celdas de cuarzo de 1 ml y se tomaron las
lecturas a 260 y 280 nanómetros (nm). Con los datos de las lecturas se obtuvieron las
concentraciones delas muestras de DNA, (Tabla 4).

Amplificación del DNA.-

Se usó la técnica de la PCR con los cebadores diseñados D16S539 CHLC, F (forward) 5´GAT
CCC AAG CTC TTC CTC TT 3´, R (reverse) 5´ACG TTT GTG TGT GCA TCT GT 3,
reportados por Murray y col., 1995, para flanquear la región del STR D16S539 en el cromosoma
16.
5´aggca gatcccaagctcttcctcttccctagatcaatacagacagacagacaggtggatagatagatagatagatagatagatagatagatagatagatatcattgaaagac
aaaacagagatggatgatagatacatgcttacagatgcacacacaaacgt aaatg 3´
Se realizaron variaciones en las concentraciones de los componentes de la PCR, con la finalidad de
obtener las condiciones óptimas para la obtención del fragmento amplificado. Para un volumen de 25
microlitros (µl) de reacción se comenzó usando 100 nanogramos (ng) de DNA, 0.75 U deElaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca
Central UNMSM

Estimación de las Frecuencias Alélicas del D16S539 en una Muestra
Poblacional de ascendencia andina ancashina. Tito Tadeo, Raúl Yhossef.
Derechos reservados conforme a Ley

TaqGold, 150 µM de cada dNTPs, 800 µM de cada cebador, 2.5mM de MgCl2 y 2.5 µl de
Buffer 10X de la TaqGold. El...