Reconocimiento de polipéptidos
Páginas: 10 (2297 palabras)
Publicado: 17 de febrero de 2010
Índice:
• Índice y objetivos: Página 1
• Separación proteínas por electroforesis (SDS-PAGE): Página 2
• Digestión con tripsina: Página 5
• Espectrometría de masas: Página 6
Objetivos:
El objetivo de la práctica consiste en aislar una proteína de un grupo de ellas e identificarla. Para alcanzar el fin del experimento se debe concluir una serie de pasos, estos siguen unatemporalidad a lo largo de cinco días.
Los procesos resumidos son:
1. Separación proteínas mediante electroforesis de 1 dimensión. (separación en función de masa).
2. Digestión con tripsina que corta la posiciones carboxilo de los residuos de Lisina y Arginina (ambos con cadena laterales cargadas positivamente).
3. Después de la hidrólisis obtenemos los péptidos.
4. Medianteuna cromatografía en fase reversa separamos los trozos obtenidos de la hidrólisis de los no cortados.
5. La medición del tamaño de péptidos la haremos mediante una Espectrometría de masas; obtenemos la huella peptídica de la proteína, que es caraterística de cada proteína.
6. La bioinformática nos permite conocer que proteína es la que estamos tratando, al acudir a una base de datos en laque introducimos el peso molecular de la proteína y de cada trozo cortado con tripsina. Para esto necesitamos un programa Aldente y nos conectaremos a él a través de un servidor de acceso libre: EXPASY.
Sin embargo, es importante definir la utilidad de cada paso a seguir en el proceso aislamiento e identificación de la molécula.
Separación de Proteínas Mediante Electroforesis (SDS-PAGE)
Esuna técnica que se utiliza para separar proteínas de acuerdo con su movilidad electroforética. Gracias al SDS la mayoría de proteínas adquieren una relación carga/masa idéntica, por lo que se obtiene un fraccionamiento que obedece únicamente a la longitud de la cadena.
El proceso de separación ocurre gracias a dos fases formadas con diferentes composiciones de geles; en la parte baja va el gelde separación más concentrado que el de empaquetamiento. Con esta distribución logramos que en el gel de empaquetamiento las moléculas corran igualmente, llegando a la vez al gel de separación, por el que corren dependiendo de su longitud.
[pic]
Para realizar la electroforesis se utilizan los siguientes compuestos químicos:
Acrilamida (C 3 H 5 NO): Es un sólido que cuando se encuentra endisolución acuosa experimenta autopolimerización de forma espontánea y lenta; el resultado es que las moléculas de acrilamida se unen cabeza con cola. Sin embargo, si se le añaden radicales libres el proceso ocurre mucho más rápido. La acrilamida es un compuesto neurotóxico.
Bisacrilamida(C7H10N2O2). Su estructura está compuesta por dos moléculas de poliacrilamida enlazadas por sus gruposamino, no reactivos de cara a la polimerización. Por ello, la bisacrilamida polimeriza conjuntamente con la acrilamida pero establece puentes entre las cadenas lineales de poliacrilamida, y así evita el deslizamiento de éstas y conduce a la formación del gel.
PSA (persulfato amónico) es la fuente de radicales libres y con ello es el iniciador de la pilomerización.
TRIS (C 4 H 11 NO 3). Su pKa esde 8,3 a 20 ° C, por lo que es un buffer muy satisfactorio en el rango de pH de aproximadamente 7 a 9. Este agente químico irá en todos los tampones: separación, empaquetamiento, de carga y reservorio, pero en diferentes concentraciones.
Glicina (amino ácido acético) (C 2 H 5 NO 2).Se ha utilizado como la fuente de iones de arrastre o lento debido a su pKa es 9,69 y la movilidad de glicinatoson tales que la movilidad efectiva se puede establecer a un valor inferior al de las proteínas más lento conocido de carga negativa neta en el rango de pH.. El pH mínimo de este rango es de aproximadamente 8,0.
Temed (C6H16N2). Es un propagador de la polimerización. Aumentando su contenido se disminuye la longitud media de la cadena de polímero y se incrementa la turbidez del gel, al tiempo...
• Índice y objetivos: Página 1
• Separación proteínas por electroforesis (SDS-PAGE): Página 2
• Digestión con tripsina: Página 5
• Espectrometría de masas: Página 6
Objetivos:
El objetivo de la práctica consiste en aislar una proteína de un grupo de ellas e identificarla. Para alcanzar el fin del experimento se debe concluir una serie de pasos, estos siguen unatemporalidad a lo largo de cinco días.
Los procesos resumidos son:
1. Separación proteínas mediante electroforesis de 1 dimensión. (separación en función de masa).
2. Digestión con tripsina que corta la posiciones carboxilo de los residuos de Lisina y Arginina (ambos con cadena laterales cargadas positivamente).
3. Después de la hidrólisis obtenemos los péptidos.
4. Medianteuna cromatografía en fase reversa separamos los trozos obtenidos de la hidrólisis de los no cortados.
5. La medición del tamaño de péptidos la haremos mediante una Espectrometría de masas; obtenemos la huella peptídica de la proteína, que es caraterística de cada proteína.
6. La bioinformática nos permite conocer que proteína es la que estamos tratando, al acudir a una base de datos en laque introducimos el peso molecular de la proteína y de cada trozo cortado con tripsina. Para esto necesitamos un programa Aldente y nos conectaremos a él a través de un servidor de acceso libre: EXPASY.
Sin embargo, es importante definir la utilidad de cada paso a seguir en el proceso aislamiento e identificación de la molécula.
Separación de Proteínas Mediante Electroforesis (SDS-PAGE)
Esuna técnica que se utiliza para separar proteínas de acuerdo con su movilidad electroforética. Gracias al SDS la mayoría de proteínas adquieren una relación carga/masa idéntica, por lo que se obtiene un fraccionamiento que obedece únicamente a la longitud de la cadena.
El proceso de separación ocurre gracias a dos fases formadas con diferentes composiciones de geles; en la parte baja va el gelde separación más concentrado que el de empaquetamiento. Con esta distribución logramos que en el gel de empaquetamiento las moléculas corran igualmente, llegando a la vez al gel de separación, por el que corren dependiendo de su longitud.
[pic]
Para realizar la electroforesis se utilizan los siguientes compuestos químicos:
Acrilamida (C 3 H 5 NO): Es un sólido que cuando se encuentra endisolución acuosa experimenta autopolimerización de forma espontánea y lenta; el resultado es que las moléculas de acrilamida se unen cabeza con cola. Sin embargo, si se le añaden radicales libres el proceso ocurre mucho más rápido. La acrilamida es un compuesto neurotóxico.
Bisacrilamida(C7H10N2O2). Su estructura está compuesta por dos moléculas de poliacrilamida enlazadas por sus gruposamino, no reactivos de cara a la polimerización. Por ello, la bisacrilamida polimeriza conjuntamente con la acrilamida pero establece puentes entre las cadenas lineales de poliacrilamida, y así evita el deslizamiento de éstas y conduce a la formación del gel.
PSA (persulfato amónico) es la fuente de radicales libres y con ello es el iniciador de la pilomerización.
TRIS (C 4 H 11 NO 3). Su pKa esde 8,3 a 20 ° C, por lo que es un buffer muy satisfactorio en el rango de pH de aproximadamente 7 a 9. Este agente químico irá en todos los tampones: separación, empaquetamiento, de carga y reservorio, pero en diferentes concentraciones.
Glicina (amino ácido acético) (C 2 H 5 NO 2).Se ha utilizado como la fuente de iones de arrastre o lento debido a su pKa es 9,69 y la movilidad de glicinatoson tales que la movilidad efectiva se puede establecer a un valor inferior al de las proteínas más lento conocido de carga negativa neta en el rango de pH.. El pH mínimo de este rango es de aproximadamente 8,0.
Temed (C6H16N2). Es un propagador de la polimerización. Aumentando su contenido se disminuye la longitud media de la cadena de polímero y se incrementa la turbidez del gel, al tiempo...
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