Reconocimiento y Cuantificacion de proteinas






Reconocimiento y cuantificación de las proteínas.

INTRODUCCIÓN
Las proteínas son moléculas que están compuestas de Carbono, Oxígeno, Nitrógeno e Hidrógeno, y muchas también, contienen Azufre, estos elementos se encuentran formando las unidades básicas de ellas, uniéndose a través de enlaces peptídicos, formados por el grupo amino y el grupo carboxilo de dos aminoácidos.

En eldía a día las proteínas se encuentran mezcladas con muchos compuestos, en el organismo están formando enzimas, ADN, ARN, membranas, entre otros. Para poder separarlas y estudiarlas existen distintos métodos, los cuales funcionan dependiendo de lo que se quiera conseguir.

Para su reconocimiento, cualitativo, se usa comúnmente reactivo Biuret, y para hacer una cuantificación se realiza unaespectrofotometría, la cual mide la capacidad de la sustancia para absorber ciertas longitudes de onda de la luz que se le hace incidir. La relación de la sustancia con la absorbancia se da por la ley de Lambert-Beer A = ɛdc Tomando como referencia una “muestra Blanco”, la cual no contiene nada. Reconociendo así que la cantidad de luz incidente es proporcional a la concentración y espesor de lamuestra problema a comparar con la muestra “Blanco”.

Como el método de reconocimiento de proteínas involucra un factor luz para identificarlas, se debe distinguir la longitud de onda en la que se determine, ya que existen proteínas que debido a su estructura no absorben luz a cierta longitud, por lo cual se utiliza luz a 280nm y a 540nm.



Objetivos:

Conocer la cantidad de SAB presente enuna muestra desconocida mediante el método de complejo Biuret-proteína y un espectrofotómetro a 540nm, realizando los cálculos con la ecuación de la recta correspondiente.

Cuantificar la cantidad de Ovoalbúmina presente en la muestra problema por medio del método de complejo Biuret-proteína y un espectrofotómetro a 280 nm.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se prepararon 3 tubos con diferentes contenidos;tubo 1, 2 y 3. Al tubo 1 se le agregó 4mL de NaCL 0,9% p/v, al tubo 2 se la agregó 4mL de seroalbúmina bovina (SAB) y al tubo 3, 4mL de ovoalbúmina.






Luego, se procedió a vaciar el contenido de los tubos en tres cubetas de cuarzo diferentes para medir su absorbancia a 280nm en el espectrofotómetro (Spectrum. SP-2000UV. UV-VIS SpectrophotoMETER). Con los datos recolectados, se pudodeterminar la concentración de ovoalbúmina (Ovo) con la siguiente ecuación:

[SAB] = Absorbancia de SAB
X Absorbancia de Ovo x=[Ovo]

Posteriormente, se diluyó a ovoalbúmina con NaCL 0,9% hasta completar 50 mL de solución en un matraz de aforo (FD= 200), para continuar con la preparación de 7 tubos de ensayocuyos componentes se indican en la siguiente tabla:

Tubos
1
2
3
4
5
6
7
Na Cl 0.9% (mL)
-
1.8
1.5
1.0
0.5
-
2.0
SAB 2,5 (mg/mL)
-
0.2
0.5
1.0
1.5
2.0
-
Plasma diluido (mg/mL) FD=80
2.0
-
-
-
-
-
-
Reactivo de Biuret (mL)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0

Se trasvasijó el contenido de los tubos en otras 7 cubetas de cuarzo de 4mL, y de esta se pudo medir laabsorbancia de cada muestra. Los datos obtenidos de absorbancia, en conjunto con la concentración de SAB permitieron la realización de una regresión lineal, que se utilizó para el cálculo/cuantificación de la concentración de proteínas de las distintas muestras.

RESULTADOS

a) Reconocimiento por absorbancia a 280nm de luz ultravioleta.
Datos:

 
  

Factor de Dilución = 200
  


b) Reconocimiento por absorbancia da 540nm (reactivo de Biuret).
Datos:
*muestra problema **muestra blanco

Donde la concentración de proteínas se obtuvo por medio de la siguiente fórmula:


C1 x V1 = C2 x V2


Ejemplo del cálculo de la concentración...