recuento de BAL
Páginas: 5 (1160 palabras)
Publicado: 23 de noviembre de 2013
3. MATERIAL Y MÉTODOS
Recuento, aislamiento e identificación de las bacterias acido lácticas.
3.1. Toma de muestras
Se obtuvieron muestras de leche, cuajada o queso en 3 industrias artesanales ubicadas en el Valle de Tulancingo, Hidalgo, que elaboran queso Oaxaca con leche cruda. En cada una de las industrias se procedió a la toma de muestras en dos días distintos de elaboración. Serecogieron muestras de las etapas consideradas claves para la elaboración del queso Oaxaca: a) leche fresca (LF) en el momento de la recepción de la misma; b) leche ácida (LA) cuando se iba a adicionar el cuajo en la leche destinada para hacer queso Oaxaca (leche con una acidez entre 18 - 20 °D); c) cuajada ácida (CA), cuajada en el momento inmediatamente anterior al malaxado (cuajada con un pH entre5,2-5,4; d) muestra de queso (Q), queso recién elaborado, en el mismo día de su elaboración, a las pocas horas después del salado, cuando se dio forma de ovillo a las correas.
Las muestras fueron recogidas en frascos (leche) o bolsas (cuajada y queso) previamente esterilizados. La cantidad de muestra recogida fue de 250 ml para LF y LA y 500 g para CA y Q. Las muestras fueron transportadas yalmacenadas a una temperatura de 4°C hasta el momento de su análisis que no superó las 4 horas.
3.2. Recuento de bacterias acido lácticas (BAL)
Se tomó una alícuota de 10 ml de las muestras líquidas (LF y LA), una vez homogenizadas por agitación, y se realizaron diluciones decimales utilizando como diluyente una solución salina peptonada estéril con 1 g de peptona (Difco, Leeuwarden, TheNetherlands) y 8,5 g de NaCl (Prolabo, Barcelona, España) por litro de solución. En el caso de las muestras sólidas (CA y Q) se homogeneizó la mitad de la muestra (250 g) en una picadora doméstica en condiciones de asepsia y se tomó una alícuota 10 g. Esta alícuota se homogenizó en un Stomacher (Seward stomacher 80, London, UK) durante 2 min en 90 ml de solución salina peptonada estéril, preparadasegún lo descrito anteriormente. A partir de esta dilución y se realizaron diluciones decimales. Se sembraron por duplicado alícuotas de 1 ml de las diluciones adecuadas en los medios sólidos utilizados para el recuento y aislamiento de las BAL.
Los recuentos de Lactobacillus spp. se realizaron por siembra en profundidad en agar Man, Rogosa y Sharpe (MRS; Oxoid, Ltd., Basingstoke, U.K.) acidificadocon ácido láctico (Panreac, Barcelona, España) a un pH de 5,5. Una vez sembrado y solidificado el medio se le adicionó a la placa una sobrecapa del mismo medio para obtener condiciones de anaerobiosis. Las placas se incubaron a 30 ºC durante 48- 72 h. Los recuentos de Lactococcus spp. se realizaron en agar M17 (Oxoid). Las placas se incubaron a 30 ºC durante 48-72 h. Finalmente, el recuento deEnterococcus se realizó en agar KF Streptococcus (Oxoid). Las placas se incubaron a 35 °C durante 48 h (Fox et al., 2000 – Fundamentals of cheese Science libro).
3.3. Aislamiento
Para cada punto de muestreo (leche fresca, leche acidificada, cuajada antes de fundir y queso), industria muestreada y día de muestreo, de las placas con crecimiento utilizadas para los recuentos se aislaron al azar10 colonias de agar MRS y M17 y 5 colonias de agar KF Streptococcus (presuntas BAL). Las colonias aisladas se sembraron en caldo triptona de soja (TSB, Bacto, Mt Printchard, Australia) con 0.5 % de extracto de levadura (YE; Difco), que fue incubado a 37 ºC durante 24 h. Transcurrido este tiempo, 1 ml de cada tubo de ensayo se introdujo en un tubo Eppendorf y se sometió a centrifugación a 12,000rpm durante 3 (Centrifuga modelo 5414, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Posteriormente se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 ml de caldo MRS (Oxoid) con glicerol (Acofarma, Barcelona, España) al 50% (v/v). Los aislamientos se mantuvieron a -40º C hasta su posterior precaracterización.
3.4. Precaracterización de las presuntas BAL
La precaracterización de las...
Recuento, aislamiento e identificación de las bacterias acido lácticas.
3.1. Toma de muestras
Se obtuvieron muestras de leche, cuajada o queso en 3 industrias artesanales ubicadas en el Valle de Tulancingo, Hidalgo, que elaboran queso Oaxaca con leche cruda. En cada una de las industrias se procedió a la toma de muestras en dos días distintos de elaboración. Serecogieron muestras de las etapas consideradas claves para la elaboración del queso Oaxaca: a) leche fresca (LF) en el momento de la recepción de la misma; b) leche ácida (LA) cuando se iba a adicionar el cuajo en la leche destinada para hacer queso Oaxaca (leche con una acidez entre 18 - 20 °D); c) cuajada ácida (CA), cuajada en el momento inmediatamente anterior al malaxado (cuajada con un pH entre5,2-5,4; d) muestra de queso (Q), queso recién elaborado, en el mismo día de su elaboración, a las pocas horas después del salado, cuando se dio forma de ovillo a las correas.
Las muestras fueron recogidas en frascos (leche) o bolsas (cuajada y queso) previamente esterilizados. La cantidad de muestra recogida fue de 250 ml para LF y LA y 500 g para CA y Q. Las muestras fueron transportadas yalmacenadas a una temperatura de 4°C hasta el momento de su análisis que no superó las 4 horas.
3.2. Recuento de bacterias acido lácticas (BAL)
Se tomó una alícuota de 10 ml de las muestras líquidas (LF y LA), una vez homogenizadas por agitación, y se realizaron diluciones decimales utilizando como diluyente una solución salina peptonada estéril con 1 g de peptona (Difco, Leeuwarden, TheNetherlands) y 8,5 g de NaCl (Prolabo, Barcelona, España) por litro de solución. En el caso de las muestras sólidas (CA y Q) se homogeneizó la mitad de la muestra (250 g) en una picadora doméstica en condiciones de asepsia y se tomó una alícuota 10 g. Esta alícuota se homogenizó en un Stomacher (Seward stomacher 80, London, UK) durante 2 min en 90 ml de solución salina peptonada estéril, preparadasegún lo descrito anteriormente. A partir de esta dilución y se realizaron diluciones decimales. Se sembraron por duplicado alícuotas de 1 ml de las diluciones adecuadas en los medios sólidos utilizados para el recuento y aislamiento de las BAL.
Los recuentos de Lactobacillus spp. se realizaron por siembra en profundidad en agar Man, Rogosa y Sharpe (MRS; Oxoid, Ltd., Basingstoke, U.K.) acidificadocon ácido láctico (Panreac, Barcelona, España) a un pH de 5,5. Una vez sembrado y solidificado el medio se le adicionó a la placa una sobrecapa del mismo medio para obtener condiciones de anaerobiosis. Las placas se incubaron a 30 ºC durante 48- 72 h. Los recuentos de Lactococcus spp. se realizaron en agar M17 (Oxoid). Las placas se incubaron a 30 ºC durante 48-72 h. Finalmente, el recuento deEnterococcus se realizó en agar KF Streptococcus (Oxoid). Las placas se incubaron a 35 °C durante 48 h (Fox et al., 2000 – Fundamentals of cheese Science libro).
3.3. Aislamiento
Para cada punto de muestreo (leche fresca, leche acidificada, cuajada antes de fundir y queso), industria muestreada y día de muestreo, de las placas con crecimiento utilizadas para los recuentos se aislaron al azar10 colonias de agar MRS y M17 y 5 colonias de agar KF Streptococcus (presuntas BAL). Las colonias aisladas se sembraron en caldo triptona de soja (TSB, Bacto, Mt Printchard, Australia) con 0.5 % de extracto de levadura (YE; Difco), que fue incubado a 37 ºC durante 24 h. Transcurrido este tiempo, 1 ml de cada tubo de ensayo se introdujo en un tubo Eppendorf y se sometió a centrifugación a 12,000rpm durante 3 (Centrifuga modelo 5414, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Posteriormente se retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 ml de caldo MRS (Oxoid) con glicerol (Acofarma, Barcelona, España) al 50% (v/v). Los aislamientos se mantuvieron a -40º C hasta su posterior precaracterización.
3.4. Precaracterización de las presuntas BAL
La precaracterización de las...
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