Registro electrofisiológico.

Las gonadotropos son sembrados sobre cajas Petri de 35mm de diámetro, los cuales son mantenidos en cultivo por 24 horas antes de iniciar su tratamiento con Leptina con el propósito de que se adaptena su condición de cultivo, posteriormente son sometidas a registro electrofisiológico mediante la técnica de patch-clamp en su configuración de célula completa en sus dos modalidades: fijación decorriente para el registro de la actividad eléctrica espontánea y fijación de voltaje para lograr disecar los diferentes componentes de la corriente iónica de membrana. El registro electrofisiológico serealiza a temperatura ambiente (19-22 °C). Las cajas Petri, son trasladadas de la incubadora a una cámara de experimentación montada en la platina de un microscopio invertido (DMIL, Leica). La cámaracontiene aproximadamente 2 ml de solución externa de registro y se conecta a tierra mediante un electrodo de referencia. La solución externa de registro se añade a la caja petri y ésta es registradahasta por 2 horas.
Los electrodos son micropipetas de vidrio duro (borosilicato; SUTTER INSTRUMENTS) que son fabricados en un estirador horizontal (P30; Sutter Instruments Co.) con resistencias entre 2y 4.5 M. Las micropipetas se llenan con solución interna de registro cuya composición varía según la corriente iónica que se pretenda aislar.
Los electrodos son conectados al transductorcorriente-voltaje del amplificador de patch clamp (Axopatch 200B), cuyo lazo de realimentación es de 500 M. El posicionamiento del electrodo sobre la célula se realiza con ayuda de un micromanipuladormotorizado (MP-225, Sutter Instruments Company). Una vez que se obtiene un gigasello eléctrico (de resistencia igual o mayor a 1 G) entre la punta del electrodo y la membrana plasmática, se aplica presiónnegativa en el interior del electrodo para romper la microárea de membrana y así establecer la configuración de célula completa. La captura de datos se inicia 30 segundos después de que se alcance la...