Reporte aminoacidos

Reporte de Enzimas


Laboratorio Bioquímica N°4



Nombre:

Carrera: Medicina Veterinaria Sección: MV-2


Desarrollo:


PARTE 1
Objetivo: determinar el pH óptimo de la enzima fosfatasa ácida de aorta de bovino.
Siguiendo los pasos indicados en la guía de laboratorio y lo que se indica en la tabla 1, Ud. podrá
determinar el pH óptimodonde la enzima presenta la mayor actividad enzimática.

Tabla 1. Protocolo para la preparación de soluciones con distintos valores de pH.

Volumen (mL)
Tubo
B
Tubo
C
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
p-nitrofenilfosfato
-
1,0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
MgCl2
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
buffer citrato
0
0
2.5 (pH 3.0)
2.5 (pH 4.5)
2.5 (pH 5.6)
2.5 (pH 7.5)
2.5 (pH9.0)
H2O
4.5
4.5
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Enzima
1.0
0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

Rotule los tubos de ensayo según corresponda y proceda a incubar a 37°C por el tiempo que le indiquen
los profesores de laboratorio. Detenga la reacción y mida absorbancia como lo indica la guía de laboratorio.

Para cada tubo debe agregar la enzima al final, luego de mezclar todos los reactivos. Explique elporqué de este paso (1 punto).



La enzima se debe agregar al final de que tenemos listas las mezclas ya que si se hace antes o entre ese proceso ésta puede producir producto antes de tiempo.




Luego de la preparación de los distintos tubos con diferentes valores de pH proceda a determinar la absorbancia para cada uno de ellos como se lo indicará su profesor de laboratorio y anoteeste valor en la tabla 2.

Para ello Ud. debe saber que la concentración de producto formado por una enzima se calcula con la fórmula: C= ABS/ ε L. Donde ε=17500 M-1 cm-1, L= 1 cm.
Recuerde que en esta actividad práctica la enzima fosfatasa ácida forma el producto llamado p-nitrofenol. Y
la velocidad de reacción de una enzima se calcula con la fórmula: velocidad = [p-nitrifenol] / t. Donde t esel tiempo de incubación.

Tabla 2. Valores de absorbancia, concentración de producto formado y velocidad de reacción de la enzima fosfatasa ácida de bovino.

Tubo
ABS Blanco (b)
ABS
muestra
ABS corregida (ABS muestra - ABS blanco)
CONCENTRACION
p-nitrofenol


(ABS / ε L)
VELOCIDAD (p-nitrofenol) /
1
0
0
0
0
0

2

0








3

0







4
0
0
0
0
0
50
0
0
0
0
(5 puntos)
Luego de realizar los cálculos de la velocidad de reacción de la fosfatasa ácida, proceda a graficar los datos (gráfico velocidad v/s pH).





Gráfica 1. La actividad catalítica de la enzima fosfatasa ácida depende del pH (3 puntos)
II. Responda y Discuta las siguientes preguntas. (Cada respuesta debe tener bibliografía).

a) Mencione sustrato(s), enzima,producto(s) que participan en la reacción estudiada (2 puntos).
Sustrato: P-Nitrofenilfosfato
Enzima: Fosfatasa acida (fosfomenoesterasa no especifica) Producto: P-Nitrofenol + Fosfato [1]

b) Explique qué tipo de reacción lleva a cabo esta enzima (3 puntos).
La enzima fosfatasa atacan uniones esteres, (quitan una molécula de monofosfato). La actividad catalítica está relacionada con el estadoiónico del lugar activo. Las variaciones de la concentración de ion de hidrogeno pueden afectar a la ionización de los grupos de lugar activo. Además cabe mencionar que la fosfatasa tiene la propiedad de catalizar la hidrólisis de fosfomonoésteres a pH 5.0 aprox. Liberando como productos de la reacción un alcohol y un fosfato inorgánico, dependiendo del sustrato utilizado, estas enzimas tienenelevada afinidad por el sustrato p-nitrofenil fosfato. [ 2]

c) ¿Cómo es la variación de la velocidad de reacción en función del pH? (2 puntos).
Un cambio brusco de pH puede alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las propiedades catalíticas de la enzima. A pH alto o bajo se produce una desnaturalización de la enzima. La intensidad...