reporte de genetica
Páginas: 13 (3098 palabras)
Publicado: 9 de julio de 2014
RESUMEN
La práctica de laboratorio N° 1 consistió en la extracción de ácidos nucleicos de tejido vegetal mediante el método de CTAB en la cual se utilizó un espécimen de hoja de Coleus sp y se extrajeron 600 gramos cortados con un microtubo, fueron triturados con un micropistilo provocando una lisis (ruptura mecánica) en las células y así lograr la liberación de ácidos nucleicos; seencubaron a una temperatura establecida de 64°c durante 40 min. En un plato caliente, se agregó cloroformo y se mezcló suavemente para luego hacer la centrifugación para separar la solución en dos componentes, se extrajo con una micropipeta la fase acuosa y se trasvaso a otro recipiente. Seguidamente se hizo la purificación de los ácidos nucleicos aplicando etanol y moviendo suavemente hasta lograr unprecipitado, se centrifugo nuevamente para formar un pellet que es la parte más importante ya que aquí es donde se encuentran los ácidos nucleicos del tejido.
INTRODUCCION
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. Losmétodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos muy purificados, que nocontengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción adecuados. Con objeto de evitar los falsos negativos debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda vivamente efectuar un experimento de control de la inhibición de la PCR, que suele hacerse mediante PCR específica de vegetales (eucariotas o cloroplastos) o de la especie.
Para extraer los ácidosnucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácidonucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
• Rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);
• Tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.);
• Digestión enzimática (Proteínas K, etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma soluciónpuede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación.
Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicasde las siguientes:
• Extracción/precipitación;
• Cromatografía;
• Centrifugación;
• Separación por afinidad.
Extracción/precipitación
A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suelerealizarse una precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la precipitación. También puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitación salina) o una precipitación de las proteínas mediante cambios del pH.
Cromatografía...
RESUMEN
La práctica de laboratorio N° 1 consistió en la extracción de ácidos nucleicos de tejido vegetal mediante el método de CTAB en la cual se utilizó un espécimen de hoja de Coleus sp y se extrajeron 600 gramos cortados con un microtubo, fueron triturados con un micropistilo provocando una lisis (ruptura mecánica) en las células y así lograr la liberación de ácidos nucleicos; seencubaron a una temperatura establecida de 64°c durante 40 min. En un plato caliente, se agregó cloroformo y se mezcló suavemente para luego hacer la centrifugación para separar la solución en dos componentes, se extrajo con una micropipeta la fase acuosa y se trasvaso a otro recipiente. Seguidamente se hizo la purificación de los ácidos nucleicos aplicando etanol y moviendo suavemente hasta lograr unprecipitado, se centrifugo nuevamente para formar un pellet que es la parte más importante ya que aquí es donde se encuentran los ácidos nucleicos del tejido.
INTRODUCCION
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. Losmétodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos muy purificados, que nocontengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción adecuados. Con objeto de evitar los falsos negativos debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda vivamente efectuar un experimento de control de la inhibición de la PCR, que suele hacerse mediante PCR específica de vegetales (eucariotas o cloroplastos) o de la especie.
Para extraer los ácidosnucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácidonucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
• Rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);
• Tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.);
• Digestión enzimática (Proteínas K, etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma soluciónpuede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación.
Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicasde las siguientes:
• Extracción/precipitación;
• Cromatografía;
• Centrifugación;
• Separación por afinidad.
Extracción/precipitación
A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suelerealizarse una precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la precipitación. También puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitación salina) o una precipitación de las proteínas mediante cambios del pH.
Cromatografía...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.