Reporteproteina 2


2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS.
Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de pollo.







INTRODUCCION:
Todos los tejidos contienen miles de proteínas que difieren en tamaño, forma y carga. Algunas tienen actividad enzimática y otras cumplen otras funciones (por ejemplo, estructurales). Siendo una condición para el estudio de la estructura y función deuna proteína específica, es su purificación a partir de los tejidos. Tomando en cuenta aspectos como: tamaño, carga, solubilidad, hidrofilicidad y función biológica.
La purificación de proteínas se lleva a cabo en tres fases:
Fase 1: Ruptura de las membranas celulares, centrifugación diferencial o centrifugación usando gradiente de densidad (para separar proteínas de las partículas subcelulares, obien, de agregados de diferente peso molecular).
Objetivo: obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración.
Metodología: depende de la dificultad que presente el material biológico para romperse y de la solución empleada para poder ajustar el pH, la fuerza iónica, inhibidores de proteasas o algún estabilizador de la proteína.
Eliminación de contaminantes: seutiliza la centrifugación para separar los componentes del homogenizado

Fase 2: Puede incluir la precipitación selectiva de proteínas por la adición de sales o disolventes miscibles en agua.
Objetivo: remover los contaminantes más pequeños, de una forma específica.
Metodología: el más utilizado es la precipitación.
Estrategias para precipitar son: cambio de pH, incremento en la temperatura, adición dedisolventes, de moléculas cargadas, etc. El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2 SO4.
Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentración de iones, fenómeno denominado de “salting in”. Pero cuando se eleva en exceso la concentración de iones, disminuye la solubilidad de las proteínas y precipitan (“salting out”). La mayor parte delas proteínas presentan en su superficie una capa de agua (capa de solvatación) que al incrementar la concentración de los iones disminuye. El mecanismo de salting-out se basa en la exclusión del cosolvente, es decir la sal establece puentes de hidrógeno con el agua y al hacerlo sustrae el agua de la proteína. Después de la precipitación hay que retirar el agente precipitante, que es comúnmente lasal.

Fase 3: Se remueven las proteínas contaminantes utilizando la separación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína.
Objetivo: obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes proteicos. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la cromatografía de exclusión molecular, de intercambio iónico, interacciónhidrofóbica y de afinidad.

a) Cromatografía de intercambio iónico: es una técnica que separa las biomoléculas de acuerdo con su carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una proteína interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria.
1) Se basa en que la carga electrostática de las proteínas depende del pH en el que se encuentran, en donde, a valores de pH menores al pI, lacarga neta de una proteína es positiva, por lo que puede unirse fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador catiónico.
2) Para eluir a la proteína de interés se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentración de sales en la resina.

b) Cromatografía de afinidad: se ocupa la afinidad específica de una proteína por un ligando, un anticuerpo o un ion metálico, parapurificarla. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es común usar al cofactor de la enzima, el NAD+ o bien un compuesto que presente alguna similitud a éste. Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la proteína de interés se unirá al ligando, mientras que el resto saldrá de la columna. Este tipo de separación, basada en el reconocimiento biológico, es muy específica y elimina...