Reportes

Introducción a la Biología Celular y Molecular

TP2: Extracción y cuantificación de proteínas
Objetivos
Obtener un extracto crudo de proteínas a partir de distintos órganos. Realizar un fraccionamiento a partir de una precipitación con Sulfato de Amonio. Cuantificar las proteínas resultantes de cada fracción.

Introducción
Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en lacélula, ellas constituyen más del 50% del peso seco de la célula. Cada tipo celular, tiene un rol específico determinado por su composición proteica. Con la posibilidad de que 20 (o 22) aminoácidos diferentes puedan estar unidos en cualquier orden para conformar polipéptidos de cientos de aminoácidos, tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variantes en su conformación. Estavariedad genera funciones tan refinadas como las de las enzimas que están involucradas en el metabolismo celular. Una bacteria puede tener cerca de 1000 proteínas diferentes, en una célula humana puede haber más de 10.000 clases de proteínas distintas. La composición protéica de las células en un determinado momento depende del conjunto de genes que se estén activando y esto está relacionadodirectamente con las señales que recibe la célula, de su micro ambiente y de las características celulares que le son propias. Es decir que el patrón proteico de una célula vegetal será distinto al de una célula animal, una célula hepática de un ratón, será distinta de una célula hepática de un humano, y a su vez una célula hepática de ratón será distinta a una neurona del mismo animal La expresión deproteínas puede estudiarse por ejemplo, mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida (TP Nº3). Para esto es necesario extraer primero las proteínas a partir de las células que constituyen los tejidos u órganos. Al momento de elegir el protocolo a seguir para obtener el extracto crudo, es importante tener en cuenta tanto el material de partida como su posterior utilización: Materialbiologico de partida-tipo de organismo: En el caso de órganos u otros tejidos animales, es necesario disgregarlos antes de proceder a la lisis celular, ya que las células se encuentran rodeadas de tejido conectivo. En general estas técnicas involucran la utilización de enzimas (como por ejemplo colagenasa) y/o una ruptura mecánica grosera. Para esto pueden utilizarse morteros, homogeneizadoreseléctricos, tijeras o tamices metálicos (mesh), entre otros. Cuando el material es un cultivo celular, la extracción puede realizarse adicionando un detergente, realizando un shock osmótico, o por sonicación. Finalidad del extracto proteico: esto determinará el buffer de extracción que se utilizará dependiendo se desea o no que las proteínas conserven su actividad biológica, su conformación nativa, suinteracción con otras proteínas u otras moléculas. Algunos protocolos son tan violentos que involucran la ruptura de todas las membranas; otros en cambio permiten fraccionar y obtener, distintos componentes subcelulares (núcleos, mitocondrias, etc). La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los métodos más utilizados se basan esencialmente en lahomogenización de los tejidos y la destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o químicos. Obteniéndose lo que se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberación de las proteínas de interés, evitando la degradación térmica o las alteraciones secudarias por oxidación, proteólisis, etc. Se han desarrollado una amplia gama detécnicas de disrupción celular, que se usan a escala de laboratorio que se pueden clasificar como: a) métodos físicos mecánicos: agitación con abrasivos, homogeneización a alta presión o extrusión por presión; b) métodos físicos no mecánicos: shock osmótico, ciclos de congelación

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descongelación, sonicación o secado; c) métodos químicos:...