Resultados De Un Práctico Con Enzimas

4- Resultados
PRÁCTICO N°5: ENZIMAS I

Resultados obtenidos de la realización del método descrito anteriormente:

Tubo N°1 | Tiempo (min) | Absorbancia | µmoles total PO4H-2 | µmoles PO4H-2 menos 0 min(0,19) | µmoles PO4H-2En 5 min |
1* | 0 | 0,038 | 0,19 | -- | -- |
2 | 5 | 0,162 | 0,84 | 0,65 | 0,65 |
3 | 10 | 0,224 | 1,17 | 0,98 | 0,33 |
4 | 15 | 0,293 | 1,54 | 1,35 | 0,37 |
5| 20 | 0,354 | 1,86 | 1,67 | 0,32 |
6 | 25 | 0,407 | 2,12 | 1,93 | 0,25 |
7 | 30 | 0,429 | 2,24 | 2,05 | 0,17 |
8 | 40 | 0,467 | 2,45 | 2,26 | 0,10 |
9 | 50 | 0,506 | 2,66 | 2,47 | 0,10 |
10 | 60 | 0,512 | 2,69 | 2,50 | 0,015 |
estándar 1 | -- | 0,183 | -- | -- | -- |
estándar 2 | -- | 0,201 | -- | -- | -- |
* El tubo 1 equivale al tiempo 0, por lo que suponemos que en este momentono se liberó fosfato.

Se observa que la absorbancia que da cada tubo es proporcional a la cantidad de fosfato liberado. Utilizando la lectura del estándar (el que equivale a 1µmol/ml de fosfato) calculamos los µmoles de fosfato que se liberaron en los distintos tiempos de incubación.

Para llegar a estos valores realizamos estos cálculos:

a) Con los 2 estándares calculamos un promediopara llegar al valor de absorbancia equivalente a 1 µmol/ml de fosfato.

Promedio = (0,183+0,201) / 2 = 0,19

b) Con el valor obtenido anteriormente, hicimos una regla de tres simple para llegar a los µmol/ml de fosfato producidos según la absorbancia de cada tubo:
Ej:
0,192 --- 1 µmol/ml de fosfato x= (0,162x1) / 0,192
0,162---- x µmol/ml de fosfatox= 0,843 µmol/ml de fosfato

c) A estos µmoles de fosfato obtenidos debemos restarle los µmol de fosfato del “tiempo 0”
Ej: 0,84 µmol/ml de fosfato - 0,19 µmol/ml de fosfato= 0,65 µmol/ml de fosfato

d) Para calcular la velocidad en 5 minutos debemos restar la cantidad de µmol/ml de fosfato menos 10 minutos del tiempo que se desea saber y la cantidad obtenida en el tiempo anteriorEj:
0’—5’ = 0,65-0,00= 0,65
5’—10’= 0,98-0,65= 0,33

En los casos, que las variaciones de tiempo son de 10 minutos, realizamos el mismo procedimiento anterior pero dividimos por 2, porque se entiende que hay dos veces 5’
Ej:
30'-40'= 2,26-2,05 = 0,10
2
Los resultados de la tabla anterior, se pueden graficar en un sistema de coordenadas de la siguiente forma:Gráfico 1: Curva de progreso de reacción enzimática
(µmoles de fosfato liberado en función del tiempo de incubación en minutos)

Con este gráfico se puede analizar que hay una relación proporcional en un principio
Se obtiene que al comienzo hay una relación directamente proporcional más cercana al tiempo 0, hasta que se va formando la curva hasta llegar a un punto donde tiende a aplanarse,denominado concentración de equilibrio.

Gráfico 2: Curva de progreso de reacción enzimática
[Velocidad (µmoles fosfato liberado en 5 min) v/s tiempo de incubación en minutos]

En este gráfico podemos observar que la velocidad de formación de producto va disminuyendo a medida que pasa el tiempo debido a que disminuye el sustrato, llegando finalmente a casi hacerse cero en elminuto 60. Se debe tener en cuenta que esta velocidad puede ser modificada por factores como °T, pH, concentración salina, cofactores, y la presencia de inhibidores.

PRÁCTICO N°6: ENZIMAS II

Actividad N°1: Efecto de la concentración de β–glicerofosfato de sodio (sustrato) sobre la velocidad de la reacción catalizada por la fosfatasa alcalina.

Como hemos mencionado, la lectura delespectrofotómetro de cada tubo es proporcional a la cantidad de fosfato liberado, utilizando la lectura del estándar de fosfato, calculamos cuánto fosfato se liberó en cada tubo.

Valores tubos estándar: 1=0,362 2=0,346 Promedio: 0,354

Con el promedio de los estándares calcularemos la concentración de cada tubo igual como se explicó en el práctico anterior.
Para obtener la...