Resumen capítulo 28 lehninger

Cap. 28 Leningher Tecnología de ADN recombinante
Localizacion, aislamiento, preparación y estudio de pequeños segmentos de DNA: clonación de ADN
Clonación de ADN: fundamentos
Clonar= copias idénticas
Separación de un gen específico o frafmento de ADN de su cromosoma, como resultado hay amplificación selectiva de un gen o fragmento de DNA particular.
5 procedimientos generales (para clonar,obviooo…):
Método para cortar el ADN en localización precisa. El descubrimiento de endonucleasas específicas de secuencia (endonucleasas de restricción).
Método para unir covalentemente 2 fragmentos de DNA. La DNA ligasa puede hacerlo.
Selección de una molécula de DNA pequeña capaz de autorreplicarse. Los segmentos de DNA que se quieren clonar pueden unirse a vectores de clonación o plásmidos.Aquellas moléculas de DNA compuestas que contienen unidos covalentemente segmentos derivados de 1 o mas fuentes se denominan ADN recombinante.
Método para trasladar el ADN desde el tubo de ensayo hacia el interior de una celula huésped que ofrece la maquinaria enzimática necesaria para la replicación de este ADN
Métodos para seleccionar o identificar aquellas células huésped que contienen elADN recombinante.
Todos estos métodos en conjunto = tecnología de ADN recombinante.









Las endonucleasas de restricción y la DNA ligasa dan como resultado el ADN recombinante

2 tipos de enzimas en métodos de generación y propagación de una molécula de ADN:
1º- endonucleasas de restricción: cortan DNA en secuencias especificas para tener fragmentos mas pequeños
2º- DNA ligasa:une el fragmento de DNA a clonar, una vez aislado, a un vector de clonación.
El vector recombinante se puede introducir en la celula huésped que lo “clona” a la vez que da lugar a muchas divisiones celulares.

Las endonucleasas de restricción reconocen y cortan ADN foráneo, se dice que este ADN será restringido.
El tamaño medio de los fragmentos, producidos en la rotura de un gran ADN porla acción de una nucleasa de restricción, se puede incrementar impidiendo que la reacción se complete. Este tipo de reacción incompleta se denomina frecuentemente digestión imparcial.
Una vez que el ADN se ha cortado en fragmentos, un frafmento de interés para el investigador se puede separar del resto mediante electroforesis en gel de agarosa o HPLC es poco practico.
Cuando se aísla elfragmento de ADN de interés, esta se une a un vector de clonación utilizando ADN ligasa. El apareamiento de las bases de los extremos cohesivos complementarios facilita la reacción de ligación. La eficacia de la ligación esta condicionada por las endonucleasas que se han utilizado para generar los fragmentos de DNA.
Antes de ligar 2 frragmentos de DNA suele resultar útil la adicion de secuencias dereconocimiento para una endonucleasa de restricción (distinta de la usada para generar fragmentos) en el punto de unión, lo que nos permitirá el corte posterior del DNA ligado en esta secuencia. Esto se hace por inserción de un fragmento de DNA sintetico que contiene la secuencia de reconocimiento necesaria entre los dos fragmentos de DNA. Este fragmento de DNA sintetico se denomina conector. Unfragmento sintetico que contenga secuencias diana para varias endonucleasas de restricción se denomina policonector.
Los vectores de clonación amplifican fragmentos de DNA insertados
Normalmente se usan 3 tipos de vectores de clonación:


Aislamiento de un gen a partir de un cromosoma celular
Se hace en 2 fases: 1) se construye una librería de DNA que contenga muchos miles de fragmentos deDNA derivados del cromosoma celular. 2) se identifica el fragmento que contiene el gen de interés mediante una propiedad que lo distinga de otros fragmentos de DNA: su secuencia
La hibridación identifica secuencias especificas en una librería de DNA
Debido a que cada gen tiene una secuencia nucleotídica particular, aquel puede detectarse con la ayuda de un fragmento de DNA marcado que le sea...