Ruta Metabólica Del Gpi

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

GENOMICA FUNCIONAL
“Análisis de expresión de genes que codifican enzimas involucradas en la Ruta metabólica del Glicofosfatidilinositol”
25/ NOVIEMBRE/2011
SEMESTRE AGOSTO-DICIEMBRE 2011
INTRODUCCIÓN:
Una ruta metabólica es una serie de reacciones consecutivas catalizadas por un enzima que produce compuestos generalmente no se almacenan en cambio, seproducen los intermedios de otras sustancias en el momento en que es necesario.
Se ha hablado ampliamente de intermedios y finalmente un producto o productos; en muchos casos, el producto final de una ruta metabólica es la sustancia inicial de otra ruta.
Las rutas metabólicas comparten varias características comunes, por ejemplo, la mayoría requiere de ATP como fuente fundamental de energía, lassustancias intermedias producidas en las rutas metabólicas las proteínas implicadas en las diferentes vías de transporte pero está claro que uno de los principales componentes de las vesículas de transporte son los lípidos que conforman las membranas de los orgánulos donantes y que pasan a formar parte de las vesículas. Los lípidos proporcionan una gran estabilidad mecánica y una fuerte tendencia aformar estructuras cerradas. Al mismo tiempo permiten un ajuste de las proteínas y aseguran la flexibilidad necesaria para el nacimiento de una vesícula y la posterior fusión. Además, muchas membranas celulares contienen lípidos de señalización que traducen señales mediante la interacción con determinadas proteínas (fosfoinosítidos, ceramidos, diaglicerol,…).
En este trabajo se discutirá, unaruta metabólica en particular, en este caso será la del ancla Glicofosfatidilinositol, comúnmente conocido como GPI. El ancla GPI consta de un lípido fosfatado, el fosfatidilinositol (PI), que se inserta y se fija en la bicapa lipídica de la membrana plasmática, un núcleo glucídico compuesto por una glucosamina + 3 manosas y un amino-alcohol, la etanolamina, que une el ancla GPI a proteínas quetienen una secuencia de aminoácidos adecuada.

Fig.1 Esquema de la estructura de Glicofosfatidilinositol.
La síntesis del ancla GPI comienza en el interior de la célula, en la superficie citoplasmática del retículo endoplásmico. El primer paso es la unión de una N-acetil-glucosamina al fosfatidilinositol (PI), un fosfolípido de membrana. En este primer paso interviene un complejo de 7 enzimas,una de ellas está codificada por el gen PIG-A en este caso nuestro gen control. En la HPN este gen está mutado, no hay actividad enzimática o está muy reducida por lo que se bloquea la síntesis del ancla GPI a este nivel. Posteriormente el PI-N-glucosamina se transloca al interior del retículo endoplásmico donde se le añaden 3 manosas en forma sucesiva y finalmente la proteína sintetizada también enel retículo endoplásmico se une al ancla GPI vía etamolamina. El complejo proteína-ancla GPI así formado viaja por el retículo endoplásmico y vía aparato de Golgi llega a la membrana plasmática donde queda unido a su superficie exterior. En este proceso actúan 25 moléculas, entre ellas 8 proteínas.

Fig 2. Esquema de la ruta metabólica de la biosíntesis del GPI.

OBJETIVOS:
* Estudiar laruta metabólica del ancla Glicofosfatidilinisitol (GPI) en Saccaromyces cerevisiae
* Identificar genes homólogos de esta ruta en Ustilago maydis
* Diseñar marcadores para identificar genes inducibles y constitutivos de la misma ruta en Ustilago maydis
* Determinar la expresión de genes específicos involucrados en la misma ruta.

METODOLOGÍA y MATERIALES:
1.- Cultivos y Medios:
a)Se emplean los medios de cultivo Medio Completo (MC)(Holliday, 1974) y Medio Mínimo (MM) (Holliday 1974). El medio de cultivo se prepara sólido, en placa, se adiciona agar bacteriológico (12 g L-1). El pH se ajusta a 3 con HCl (0.1 N) o a pH 7 con NaOH (0.1 N). Para el cultivo de la forma micelial se emplea el medio de pH 3 (Ruiz-Herrera et al., 1995).
b) Para iniciar los cultivos, se debe de...