sapos y lagartos

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
Área de Conocimiento de Ciencias del mar
Depto. Académico de Biología Marina
Laboratorio de Genética Molecular
Práctica No.3
“PCR y enzimas de restricción”
Castañeda Reyes Román Israel.
Chuba Alcantara Ehiry
Monteverde Arballo Gerardo Emmanuel.
La Paz, B.C.S. a 04 de Octubre del 2012.


Introducción

Case It! es un simulador abierto queincluye métodos de análisis de ADN (digestión de restricción y cartografía, reacción en cadena de polimerasa [PCR], electroforesis de ADN, transferencia Southern y análisis de transferencia de puntos) y proteínas (electroforesis de proteínas, transferencia Western, ELISA) en una versión interactiva de un laboratorio húmedo (Resource Manual for Case It!).
Tras la extracción del ADN a partir de untejido se obtiene el ADN total contenido en el conjunto de células del tejido utilizado. Este ADN se puede observar como un precipitado, que es posible resuspender en agua o en un tampón apropiado. Si se separa mediante electroforesis en gel de agarosa se observa como una única banda de elevado peso molecular. Frecuentemente el objetivo de un experimento es analizar un fragmento concreto, quepuede ser o no conocido, del ADN extraído. Para poder aislarlo a partir de ese ADN total se obtiene una gran cantidad de copias del fragmento de interés mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction), técnica que resulta fundamental para muchas de las aplicaciones de la biología molecular (McPherson et.al, 1991).

Las enzimas de restricción sonendonucleasas que clivan (hidrolizan) en una forma específica puentes fosfodiéster 3' - 5' entre pares de bases adyacentes en la doble cadena de ADN. Las enzimas de restricción reciben su nombre de la bacteria de la que fueron aisladas por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens. Las tres primeras letras en el nombre de la enzima, corresponden la primera al género (E) ylas otras dos a la especie (co). Éstas pueden ir seguidas por la designación de una cepa (R) y un número romano (I) para indicar el orden del descubrimiento. El tipo más común de enzimas de restricción (tipo II) usado en la tecnología del ADN recombinante proviene de bacterias y no requiere fuente de energía para el clivaje del puente. Requiere en cambio iones Mg++ para la unión específica al ADN yposterior clivaje. Otras enzimas de restricción clivan palíndromos de ADN de 4 o 6 pb. Algunas otras enzimas de restricción clivan una secuencia única. Estas enzimas que reconocen la misma secuencia se llaman isochizomers (Murray y Mayes, 1999).


Objetivo

Conocer a fondo el uso de técnicas de mapeo genético con la ayuda de herramientas como case it.

Metodología

Como herramienta detrabajo se utilizó el programa de simulación “Case it”. En la pantalla Data screen, se seleccionó el comando DNA para abrir los archivos DNA homozygous norm.gen, DNA homozygous mut.gen y DNA heterozygous.gen. Se prosiguió con la selección del comando Primer en la pantalla Data screen y se abrió el archivo Primers CF Case A. Después se continuo con la selección de los 3 pcr de la ventana opened &procesed, se selecciono el comando run, run pcr. Enseguida se simuló, la digestión del ADN seleccionando Enzyme Mspl, se seleccionó el ADN (pcr) de la ventana opened & procesed y se utilizó el comando cut DNA, with a single enzyme. Para el gel de electroforesis se seleccionaron las muestras digeridas por separado, seleccionando 1 pozo del 1 al 8 y el comando load para cargar el gel, después se corrióel gel seleccionando el comando RUN, Run DNA or Protein gel. Después se prosiguió con la tinción para poder ver el bandeo, luego se etiquetó. Por último se realizó el mismo procedimiento del 5 al 7, pero con las muestras de DNA y con las muestras de PCR para comparar los resultados obtenidos.



Resultados













Discusión
Debido a que no se pudo utilizar un laboratorio...