sds protocolo

WESTERN BLOT

Preparación de las muestras-SDS-PAGE
1.- Largar 5 ml de cultivo líquido del clon bacteriano seleccionado.
2.- Preparar las muestras a sembrar de la siguiente manera:
A) 10 µlbuffer de lisis 4X + 29 µl de H2O + 1 µl del cultivo anterior.
B) 10 µl buffer de lisis 4X + 25 µl de H2O + 5 µl del cultivo anterior.
3.- Hervir las muestras preparadas durante 5 minutos. Centrifugara máxima velocidad durante 5 minutos.
4.- Sembrar 10 µl de las muestras en un SDS-PAGE 12 % (preparado según protocolo estándar, Sambrook et al). Aplicar un campo electromagnético constante de 40 mAdurante 1 hora.

Transferencia
5.- Embeber en buffer de transferencia (48 mM Tris, 39 mM glicina, 20% metanol, 0,037 % SDS) los papeles de filtro y la membrana.
6.- Preparar la transferenciade acuerdo a la siguiente figura.









7.- Transferir durante 45 minutos a 25 V.

Incubación con anticuerpos
8.- Colocar la membrana en solución de bloqueo (PBS 1X, 5 % lechedescremada). Incubar ON a 4 ºC en agitación.
9.- Realizar 3 lavados con PBS 1X durante 5 minutos en agitación.
10.- Incubar con una dilución 1/1000 del anticuerpo primario (anti-Z hecho en conejo) en PBS 1X,2 % de leche descremada y 0,1 % de tween 20 durante 1 hora a 37 ºC en agitación.
11.- Realizar 3 lavados con PBS 1X, 0,1 % Tween 20 durante 5 minutos en agitación.
12.- Incubar con una dilución1/10000 del anticuerpo secundario (anti-rabbit conjugado con peroxidasa) en PBS 1X, 2 % de leche descremada y 0,1 % de tween 20 durante 1 hora a 37 ºC en agitación.
13.- Realizar 3 lavados con PBS 1X,0,1 % Tween 20 durante 5 minutos en agitación.

Revelado (procedimiento en cuarto oscuro)
14.- Agregar sobre la membrana la solución que contiene Luminol y H2O2 (1 ml de solución A + 600 µl desolución B) de acuerdo a las especificaciones del fabricante, PB-L.
15.- Escurrir la membrana, envolverla en papel film e incubarla durante 1 minuto, junto con la placa radiográfica en el cassette que...