Secuenciación de acidos nucleicos

Secuenciación de los ácidos nucleicos
Inicialmente, se pensaba que la secuenciación de los ácidos nucleicos era mucho más difícil que la de las proteínas, y muy poco progreso se hizo hasta 1960. Esto se debió, en parte, a la falta de substratos puros del tamaño adecuado, con los cuales desarrollar los métodos y en parte, a la composición de los ácidos nucleicos. Se esperaba que lainterpretación de los resultados de la secuenciación de los ácidos nucleicos (cuatro monómeros) fuera más difícil que el de las proteínas (20 aminoácidos), y se tendrían que aislar productos de degradación más grandes para poder traslaparlos y deducir sus secuencias. Por otro lado, el hecho de tener cuatro componentes solamente, se pensaba, haría más fáciles los analices finales. Al inicio, la dificultadpredominante fue la interpretación de los resultados, pero a medida que las técnicas se fueron mejorando y que se fueron estudiando moléculas más largas, la cuestión del análisis empezó a ser más importante. Hoy, la secuenciación de ácidos nucleicos es más rápida y simple que la secuenciación de proteínas.

La Estrategia básica de la secuenciación de ácidos nucleicos es idéntica a la que se utiliza enla secuenciación de proteínas. Ésta involucra:

1.- La degradación específica y el fraccionamiento de los polinucleótidos de interés a fragmentos suficientemente pequeños para ser secuenciados.

2.- La secuenciación de los fragmentos pequeños.

3.- El Ordenamiento de los fragmentos a través de la repetición de los pasos anteriores, usando un procedimiento de degradación que produce unaserie de fragmentos de polinucleótidos que traslapan el punto de corte en la primera serie.

A finales de los años 70 comenzaron a desarrollarse los métodos para la secuenciación de fragmentos de ADN. Tanto el método químico desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert, como el método enzimático o de los "dideoxi", desarrollado por Fred Sanger compartían un principio común: la generación de cadenassencillas de ADN, marcadas radiactivamente, cuyo tamaño se diferenciaba del de la siguiente cadena en una única base, y que podían separarse por su diferente movilidad electroforética en geles desnaturalizantes donde los diferentes fragmentos capaces de impresionar una placa de autorradiografía aparecían como una escalera de bandas. La productividad anual de la técnica era de aproximadamente 1500bases/persona.

Después De 1975, se realizó un progreso dramático en la tecnología de la secuenciación de los ácidos nucleicos. Tres avances hicieron esto posible:

1.- El Descubrimiento de las endonucleasas de restricción, enzimas que cortan ADN de cadena doble en secuencias específicas.

2.- El desarrollo de mejores técnicas de secuenciación de ADN.

3.- El Desarrollo de técnicas declonación que permitieron la adquisición de un segmento de ADN en las cantidades necesarias para secuenciarlo.

En 1977, se reportaron dos protocolos para la secuenciación de ADN. El primer método fue el de Maxam Y Gilbert. Con este método, al igual que con el de Sanger, se obtiene una autoradiografía en donde puede leerse una secuencia. Sin embargo, se determina la secuencia de una moléculade ADN utilizando químicos que cortan en posiciones específicas fragmentos marcados en sus extremos 5’. El Segundo método es el de Sanger. Éste Utiliza un templado de ADN de cadena sencilla para sintetizar la hebra complementaria, la cual se termina en posiciones específicas. En Los dos casos, la secuencia de la molécula se determina por diferencias en los tamaños de los fragmentos generados.

Elmétodo de degradación química (Maxam and Gilbert, 1977).

En este método, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos 5´ o 3´ de una o ambas hebras con 32P. Después, la muestra de ADN se divide en cuatro alícuotas y se fragmenta en cuatro reacciones químicas distintas. Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por electroforesis en...