Secuenciacion De Proteinas



NOS PERMITE CONOER LA FUNCION MEDIANTE LA COMPARACION DE PROTEINAS ANALOGAS.



CONOCER LA SECUENCIA DE UNA PROTEINA NOS PERMITE CONOCER SU ESTRUCTURA TERCIARIA.

PASOS PARA SECUENCIARUNA PROTEÍNA
 FASE 1: DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS:  HIDRÓLISIS ÁCIDA CON HCL 6N. RUPTURA ENLACES PEPTÍDICOS.  SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AA. CROMATOGRAFÍA DE

INTERCAMBIOIÓNICO.

FASE 2: IDENTIFICAR EL AA N-TERMINA, MARCAJE DEL AA N-TERMINAL 1-FLUORO-2,4-DINITROBENCENO (FDNB) CLORURO DE DANSILO (CLDNS) HIDRÓLISIS DEL PÉPTIDO SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AA MARCADO(CROMATOGRAFÍA, ELECTROFORESIS)  IDENTIFICACIÓN DEL RESIDUO C-TERMINAL  HIDRAZINA (NH2-NH2): ROMPE ENLACES PEPTÍDICOS Y FORMA DERIVADOS DE HIDRAZINA CON TODOS LOS AA EXCEPTO EL C-TERMINAL
    

CARBOXIPEPTIDASA A: HIDROLIZA EL ÚLTIMO ENLACE PEPTÍDICO

Fase 3: Degradación de EDMAN

    

MARCAR EL AA N-TERMINAL CON FENILISOTIOCIANATO (PITC) EN MEDIO ALCALINO (SE FORMA ELDERIVADO FENILTIOCARBANILO) SE HIDROLIZA EL ENLACE PEPTÍDICO ENTRE LOS RESIDUOS 1 Y 2 (MEDIO ÁCIDO ANHIDRO FUERTE) SE IDENTIFICA EL DERIVADO DEL RESIDUO N-TERMINAL POR HPLC EL RESTO DEL POLIPÉPTIDOSIGUE INTACTO POR LO QUE PUEDE REPETIRSE EL PROCESO PARA DETERMINAR EL 2º AMINOÁCIDO POR REPETICIÓN CONTINUADA PUEDE SECUENCIARSE EL POLIPÉPTIDO DESDE EL EXTREMO N-TERMINAL




PARA DETERMINAR LACOMPOSICIÓN DE LA CADENA:

HIDRÓLISIS COMPLETA  HIDRÓLISIS PARCIAL:

EJEMPLOS: 1.- LA HIDRÓLISIS CON TRIPSINA DE UN PÉPTIDO X, DIO TRES PÉPTIDOS, CUYA COMPOSICIÓN CUANTITATIVA ES LA SIGUIENTE:A: ALA, LYS B: ALA, LYS, MET, TYR C: GLY, ILE, SER, TRP EL TRATAMIENTO ANÁLOGO PARA LOS PÉPTIDOS CON QUIMIOTRIPSINA DE X, DIO POR RESULTADO: D: ALA, ALA, LYS, TYR E: MET, LYS, SER, TRP F: GLY, ILEDEDUCIR LA SECUENCIA DEL PÉPTIDO X ALA – LYS –ALA –TYR – MET – LYS – SER –TRP - GLY/ILE ------------ ---------------------------------------------------- CON TRIPSINA ----------------------------...