Secuenciasion
Páginas: 5 (1172 palabras)
Publicado: 10 de agosto de 2010
Pyrosequencing. Es una técnica no fluorescente que mide la liberación de fosfato inorgánico, el cual se convierte a luz visible por una serie de reacciones enzimáticas. Se basa en la manipulación de la DNA polimerasa mediante la adición limitante de dNTPs no modificados.
Durante la reacción de polimerización, cada nucleótido se adiciona de forma separada, lo cual hace posible seguir el ordende adición de cada uno de los nucleótidos.
Paso 1
Se aparea el iniciador que sera usado para secuenciación al DNA molde, el cual debe ser de cadena sencilla (por lo general son productos de PCR). Estos se incuban con las enzimas DNA polimerasa, ATP sulforilasa, Luciferasa y Apirasa, ademas de los substratos adenosina 5’-fosfosulfato (APS) y Luciferina.
Paso 2
El primero de los cuatrodNTPs se agrega a la reacción. La DNA polimerasa cataliza la incorporación del dNTP a la cadena de DNA, siempre que el nucleotido añadido sea complementario a la cadena molde. Cada incorporación de un nucleotido libera pirofosfato (PPi) en una cantidad equimolar a la cantidad de nucleotidos adicionados.
Paso 3
La ATP sulfurilasa, cuantitativamente convierte el PPi a ATP en presencia deadenosin 5´ fosfosulfato.
El ATP producido, permite la conversion de lucifirena a oxiluciferina, reaccion catalizada La luz producida, se detecta en una camara por la enzima luciferasa, lo cual genera luz que tiene un dispositivo acoplado por carga visible en cantidades que son proporcionales a (CCD) y se visualiza en forma de un pico en el la cantidad de ATP. pirograma. Cada señal de luz esproporcional al número de nucleotidos incorporados.
Paso 4
Mediante la enzima apirasa (nucleotidasa), se degradan continuamente los dNTPs no incorporados y el exceso de ATP. Una vez que se completa la degradación se agrega otro dNTP.
Nota: Se usa desoxiadenosin alfa-thio trifosfato (dATPS) , en lugar de dATP, ya que este ultimo interfiere con la luciferasa dando señales inespecíficas
Paso 5El proceso continua hasta que se copia la cadena molde, la secuencia nucleotidica se lee en el pirograma que se construye con los picos generados.
Pyrosequencing.
Se pueden secuenciar 25 millones de nucleótidos en cuatro horas, utilizando placas de 6.4 cm2. La velocidad de obtención de secuencias es 100 veces mas rápida que cualquiera de las técnicas basadas en el método de Sanger.Desventajas: Se generan lecturas de secuencias de 100 pb, lo cual limita su uso a estudios de expresión, secuenciación para la búsqueda de SNPs, mapeo de genomas en los que exista una secuencia de referencia.
NO se aplica para la secuenciación “de novo” de genomas completos.
Para bacterias la secuenciación de 20-100 pb de regiones variables del gen 16S ribosomal, se utiliza para suidentificación.
CYP2D6 multiplex assay for the identification of alleles 2, 3 and 7. In the upper part of the figure, the PCR fragment and sequences to be identified are shown in color for the three positions. The same colors show the expected incorporation in the histograms (left) and the corresponding Pyrograms are presented to the right. Polymorphic positions are marked with yellow. A) Normalgenotype B) Heterozygous allele 3 C) Heterozygous allele 2.
Etiquetas de secuencia expresadas («Expressed sequence tags, EST)
Las secuencias EST son generadas tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola reacción de secuenciación que abarca 300-500 pb del clon. La combinación de la información generada por los EST (nivel y localización espacio/ temporal de la expresióngénica) y la de los proyectos de secuenciación de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de expresión y homología estructural que en muchos casos facilitan la inferencia de la posible función de los genes identificados.
Pirosecuenciación de ESTs
Teóricamente en el genoma humano, 8 o 9 nucleótidos deberían definir una secuencia génica. Sin...
Durante la reacción de polimerización, cada nucleótido se adiciona de forma separada, lo cual hace posible seguir el ordende adición de cada uno de los nucleótidos.
Paso 1
Se aparea el iniciador que sera usado para secuenciación al DNA molde, el cual debe ser de cadena sencilla (por lo general son productos de PCR). Estos se incuban con las enzimas DNA polimerasa, ATP sulforilasa, Luciferasa y Apirasa, ademas de los substratos adenosina 5’-fosfosulfato (APS) y Luciferina.
Paso 2
El primero de los cuatrodNTPs se agrega a la reacción. La DNA polimerasa cataliza la incorporación del dNTP a la cadena de DNA, siempre que el nucleotido añadido sea complementario a la cadena molde. Cada incorporación de un nucleotido libera pirofosfato (PPi) en una cantidad equimolar a la cantidad de nucleotidos adicionados.
Paso 3
La ATP sulfurilasa, cuantitativamente convierte el PPi a ATP en presencia deadenosin 5´ fosfosulfato.
El ATP producido, permite la conversion de lucifirena a oxiluciferina, reaccion catalizada La luz producida, se detecta en una camara por la enzima luciferasa, lo cual genera luz que tiene un dispositivo acoplado por carga visible en cantidades que son proporcionales a (CCD) y se visualiza en forma de un pico en el la cantidad de ATP. pirograma. Cada señal de luz esproporcional al número de nucleotidos incorporados.
Paso 4
Mediante la enzima apirasa (nucleotidasa), se degradan continuamente los dNTPs no incorporados y el exceso de ATP. Una vez que se completa la degradación se agrega otro dNTP.
Nota: Se usa desoxiadenosin alfa-thio trifosfato (dATPS) , en lugar de dATP, ya que este ultimo interfiere con la luciferasa dando señales inespecíficas
Paso 5El proceso continua hasta que se copia la cadena molde, la secuencia nucleotidica se lee en el pirograma que se construye con los picos generados.
Pyrosequencing.
Se pueden secuenciar 25 millones de nucleótidos en cuatro horas, utilizando placas de 6.4 cm2. La velocidad de obtención de secuencias es 100 veces mas rápida que cualquiera de las técnicas basadas en el método de Sanger.Desventajas: Se generan lecturas de secuencias de 100 pb, lo cual limita su uso a estudios de expresión, secuenciación para la búsqueda de SNPs, mapeo de genomas en los que exista una secuencia de referencia.
NO se aplica para la secuenciación “de novo” de genomas completos.
Para bacterias la secuenciación de 20-100 pb de regiones variables del gen 16S ribosomal, se utiliza para suidentificación.
CYP2D6 multiplex assay for the identification of alleles 2, 3 and 7. In the upper part of the figure, the PCR fragment and sequences to be identified are shown in color for the three positions. The same colors show the expected incorporation in the histograms (left) and the corresponding Pyrograms are presented to the right. Polymorphic positions are marked with yellow. A) Normalgenotype B) Heterozygous allele 3 C) Heterozygous allele 2.
Etiquetas de secuencia expresadas («Expressed sequence tags, EST)
Las secuencias EST son generadas tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola reacción de secuenciación que abarca 300-500 pb del clon. La combinación de la información generada por los EST (nivel y localización espacio/ temporal de la expresióngénica) y la de los proyectos de secuenciación de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de expresión y homología estructural que en muchos casos facilitan la inferencia de la posible función de los genes identificados.
Pirosecuenciación de ESTs
Teóricamente en el genoma humano, 8 o 9 nucleótidos deberían definir una secuencia génica. Sin...
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