semana 14

SEMINARIO SEMANA Nº 14TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR, APLICACIÓN EN MEDICINA

1. Explique la técnica PCR (Reacción en cadena de polimerasa). Aplicaciones en medicina.



2. Explique la técnica de ELISA (Enzyme-LinkedInmunoSorbentAssay) indirecto y sus aplicaciones en medicina.
DEFINICIÓN DE ELISA:
La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático ampliamente empleado en el área médicapara la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antígenos de patógenos, toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son también muy usadasen los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés en cada caso.
*Inmunoensayo es un conjunto de técnicas inmunoquímicas analíticas de laboratorio que tienen en común el usar complejos inmunes, es decir los resultantes de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito (sustancia objeto de análisis.El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente reveladamediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Pasos generales de un ELISA.
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpoespecífico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del substrato
9. Unión del substrato a la enzima
10.Desarrollo del color

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) peroen las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) conuna enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Uso médico
-Diagnóstico de infecciones pormicrorganismos: al detectar la presencia de antígenos del agente infeccioso.
-Confirmación de presencia de anticuerpos: pueden ser anticuerpos contra cualquier microrganismo, inclusiva vacunas, autoanticuerpos, etc
-Cuantificación de metabolitos: hormonas, medicamentos, etc

3. Explique la técnica de ELISA (Enzyme-LinkedInmunoSorbentAssay) indirecto y sus aplicaciones en medicina.
ELISA...