seminario integracion

Guía de trabajo para Laboratorio de integración
1. El gen At5G51990 de Arabidopsis, es inducido ante estrés salino. Diseñe un experimento que le permita analizar cómo se afecta el transcriptoma en aunsencia de la proteína codificada por dicho gen

Pedir 2 lineas mutantes insercionales para el gen At5G51990 en diferentes regiones del gen, crecer las semillas, genotipificar las plantas crecidaspara identificar las plantas homocigotas para la mutacion insercional y trabajar con estas.
Crecer las líneas mutantes insercionales mas la WT en medios que confieran el estres salino. Realizar un Northen Blot a las plantas para comprobar que el gen At5G51990 no se exprese en las mutantes insercionales (knockout). Al no haber transcrito no habrá proteína codificada por tal gen.
Analizar eltranscriptoma de las líneas mutantes insercionales y WT en condiciones de estrés salino mediante Microarreglo, constrastando con la condición normal sin estrés para analizar qué genes son inducidos, reprimidos o no cambian en presencia del estrés y ausencia de la proteína del gen At5G51990.

2. Demuestre experimentalmente que el gen HopI1 de Pseudomonas syringae es un efector patogénico queinterrumpe la defensa mediada por ácido salicílico en Arabidopsis thaliana.
Como el producto génico de Hopl1 es un efector que interrumple la defensa mediada por acido salicílico, la planta afectada por este efector no podrá generar HR ni SAR (la planta no puede responder a patógenos) y será susceptible a patógenos que antes eran incompatibles.
Clonar el gen Hopl1 en un plasmido Ti, bajo el controldel promotor 35S para intregarlo en Arabidopsis mediante Agrobacterium tumefaciens junto a un gen de resistencia a kanamicina (generar planta transgénica del gen Hopl1) utilizando la técnica de floral dip.
Crecer las semillas generadas en medio con kanamicina y realizar un PCR de confirmación de la insercion a las plantas crecidas. Ademas se puede realizar un Northen Blot para comprobar que el genHopl1 se expresa en la planta o un Western Blot para comprobar que la proteína se expresa.
Una vez confirmada que la planta es exitosamente transgénica para el gen Hopl1, realizar ensayos de susceptibilidad a patógenos avirulentos o que antes eran incompatibles para la planta a la línea WT y la línea transgénica, donde la línea transgénica debería ser susceptible o más susceptible que la WT paralos patógenos ya que el gen Hopl1 expresado en Arabidopsis interrumpe la repuesta a patógenos mediada por Acido Salicilico.


3. En experimentos de transcriptómica se encontró un gen que es inducido 6 veces por luzz UV. ¿Cómo probaría que este gen participa de la protección contra UV en plantas de Arabidopsis thaliana?

Identificar el gen que es inducido 6 veces por luz UV
Realizarun qRT-PCR para cuantificar la expresión en condición normal y condición de luz UV, verificar que aumenta alrededor de 6 veces como se señalo en los experimentos de transcriptomica.
Pedir 2 líneas mutantes insercionales para el gen, genotipificarlas, trabajar con homocigotas y realizar Northen Blot para confirmar que el gen no se exprese.
Además generar una línea transgénica que sobreexprese elgen.
Analizar la susceptibilidad de todas las líneas a la luz UV (Medir formación de dímeros de timina, producción de ABA, etc). Donde las mutantes insercionales deberían verse mucho más afectadas por la luz UV que la WT y la línea transgénica del gen ser más resistente que todas las demás líneas.

4. La papa es capaz de producir una toxina péptica llamada Snakina-2 (StSN2) que afecta apatógenos fúngicos y bacterianos. Como haría para generar plantas de tomate que expresen la proteína y para luego comercializar los frutos.
Generar un constructo del gen de la toxina péptica StSN2 bajo el control de un promotor endógeno de tomate, el cual será insertado en este.
Mediante alguna técnica de transgénesis (Agrobacterium a callosy micropropagacion en medio selectivo por ejemplo, floral...