Seminario

I.HERRAMIENTAS PARA LAS TÉCNICAS MOLECULARES

I.1. ENZIMAS DE RESTRICCION
1.-Concepto:
Una enzima de restricción (o Endonucleasas de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la enzima.Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. (1.1)
El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de la ruptura de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modoespontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía (Apareamiento de Watson & Crick).
Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas (ver anexo 1.1.1). Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro deeste grupo de vectores están los Plásmidos (ver anexo 1.1.2), moléculas circulares de ADN halladas en las bacterias.
Uno de los campos en los que el uso de enzimas de restricción ha tenido mayor implicación ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si éstas se producen enun sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.
2.-Nomenclatura
El nombre de cada enzima de restricción está asignado según el origen bacteriano de la misma. Lanomenclatura utilizada para denominar estas enzimas consiste en:
1º. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del nombre se escriben en cursiva.
2º. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli )
3º. En números romanos, un número para distinguirsi hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción.
4º. Todas deberían llevar adelante una R de restricción o un M de metilasa según la función de la enzima, pero generalmente se omite.
De esta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se construiría de la siguiente manera:
NOMENCLATURA | EJEMPLO |CORRESPONDE A : |
E | Escherichia | Género de la bacteria |
Co | coli | Especie de la bacteria |
R | RY13 | Cepa de la bacteria |
I | La primera enzima identificada | Orden de identificación de la enzima en la bacteria |

Ejemplos:
Origen bacteriano | Nombre de enzima |
Escherichia coli | EcoRI |
Bacillus amyloliquefaciens | BamHI |Diplococcus pneumoniae | DpnI* |
Haemophilus influenzae | HindIII |
Haemophilus influenzae | HinfI |
Staphylococcus aureus | Sau3A |
Streptomyces achromogenes | SacI[1] |

3.- Clasificación:
Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:
* Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer lasecuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.
* Tipo 2: Solo tienen actividad de...