Seminario

Clonación y expresión de MPR-TM649-705 La membrana región proximal (MPR) del VIH-1 gp41 es importante para el diseño de una vacuna mucosal contra el VIH-1. El transmembrana (TM) de dominio del VIH-1 gp41 juega un papel esencial en el anclaje de la envolvente compleja en la membrana viral y también es crucial para su función biológica en la fusión y el virus de entry.51-53 bacteriana expresión deestos dos dominios hidrófobos de VIH -1 ha demostrado ser difíciles y experimentos anteriores en nuestros laboratorios que hacen uso de la expresión P8CBD vector57 resultado extremadamente pobre acumulación de correctamente orientada MPR-TM (Gong, Kessans, Fromme y Mor, inédito). En nuestro estudio, la porción del VIH-1 Env gen que codifica para MPRTM se clonó en el vector de expresión pMIS2.1mvpara obtener pMistic-MPR-TMTEV-6His [Fig.2 (A)]. Este vector dirige la expresión estrictamente regulados de una fusión de traducción C-terminal entre la Figura 2. A: Construcción del vector de expresión para pMistic-MPR-TMTEV-6His. Ver texto e información de apoyo para los detalles. B: Esquema de la proteína de fusión Mistic-MPR-TMTEV-6His. C: Secuencia de aminoácidos de Mistic-MPR-TMTEV-6His.Púrpura: His; Verde: Mistic; rojo: MPR-TM; subrayada ELDKWA: el epítopo mAb 2F5 núcleo; subrayada NWFDI: el epítopo núcleo 4E10 mAb; sitios de reconocimiento de TEV: azul. Tenga en cuenta que la escisión se produjo entre Q y G residuos de la secuencia de reconocimiento de TEV ENLYFQG.
B. subtilis proteína integral de membrana y Mistic MPR-TMTEV-6His en E. coli [Fig. 2 (B, C)]. Mistic era demostradopreviamente para mejorar como traslacional fusión socio de los niveles de expresión y la acumulación de varias proteínas de membrana en sus conformaciones nativas. 56 Para permitir la eliminación de la fusión Mistic socio antes de los futuros experimentos de cristalización, virus del grabado de dos tabaco (TEV) el reconocimiento de la proteasa sites58 fueron introducidos por los cebadores de PCR.Uno TEV sitio de reconocimiento de proteasa se introdujo en el Nterminus de MPR-TM649-705 y el otro era situado en el C-terminal [Fig. 2 (B, C)]. El recombinante plásmido pMistic-MPR-TMTEV-6His fue transformado en E. coli C41 (DE3) las células para la expresión.La purificación del MPR-TMTEV26His. Después las células se lisaron mediante microfluidización, la mayoría de la proteína de fusiónMistic-MPR-TMTEV-6His era encontrado en la fracción de membrana, y una purificación protocolo fue desarrollado para permitir la purificación eficiente sin comprometer la integridad estructural de la proteína (Fig. 3). Tras una amplia proyección de varios detergentes (datos no mostrados), bDDM al 1% era utilizado para extraer la proteína de fusión de la membrana. El extracto bDDM fue sometido a TALONmetales cromatografía de afinidad para separar etiquetado-His Mistic- MPR-TMTEV-6His de otros proteins.59,60 El segundo fracción de elución contenía la mayor parte de Su-etiquetados proteínas, que mostró un patrón complejo de bandas sobre SDS-PAGE fraccionamiento (Fig. 4). La parte superior banda (marcada con flechas azules) correspondió a la proteína de fusión Mistic-MPR-TMTEV-6His, con un molecularmasa de 31 kDa, en buena concordancia con su calculada tamaño esperado. Cuatro bandas de contaminantes fueron visible. La segunda banda de la parte superior de la silverstained SDS-PAGE en la Figura 4 corresponde a una
Marcada con His fragmento de Mistic y MPR-TMTEV-6His, ya que podría ser detectado en las inmunotransferencias por la MPRspecific mAb 2F5 (Fig. 4). En contraste, los tres más bajabandas, claramente visible en los geles teñidos con plata, hizo no reaccionar con el 2F5 Ab (Fig. 4) y podría ser Histagged fragmentos de Mistic sin MPR o no relacionados E. coli proteínas. Hemos observado que la degradación era una problema común para las construcciones de fusión Mistic (datos no mostrado). El siguiente paso en nuestro esquema de purificación (Fig. 3) fue la escisión específica de...