seminario1 inulina3

Determinación
Fluorimétrica de inulina
usando Acido-5quinolineborico
Takahiro Rikita
Yuga Egawa
Toshinobu Seki
Daniel Raydan 11-10846
Marco Filoseta 11-10330

Analytical Biochemestry 426 (2012), 2426

Contenido


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

Motivo práctico:
› Los Riñones
› Tasa de filtración glomerular (GFR)
› Inulina
Problema
Antecedentes
Metodología
Resultados
Conclusiones

Motivo práctico

Motivopráctico
La medición de la Tasa de
Filtración Glomerular (GFR), es
una prueba de gran utilidad para
conocer si los riñones están
filtrando el plasma
adecuadamente (depurador), o si
existe indicativo de mal
funcionamiento en el mismo.

Los riñones extraen de un volumen
de plasma las sustancias toxicas
excretadas hacia la orina.

Motivo práctico
Para la determinación del GFR debe entonces
escogerse unasustancia (X), cuya depuración sea
equivalente al volumen de plasma filtrado, para ello
la sustancia X debe cumplir:
• No puede ser reabsorbida, ni secretada,
ni degradada, ni sintetizada a nivel tubular
• Debe filtrar libremente

Motivo práctico
La cantidad de X no
filtrada por el riñón
pasa nuevamente al,
plasma sanguíneo.

Cantidad de X filtrada = cantidad de X excretada

Motivo práctico
LaInulina es un
polisacárido de la fructosa
que satisface las
condiciones de depurador
(filtrable, no secretada, ni
absorbida, ni sintezida
anivel glomerular).
Está constituida por
moléculas de fructosa
unidas por enlaces B-(1-2)
fructosil-fructosa .

Problema
¿Cómo determinar la concentración
de inulina?

Esta determinación puede
ser utilizada como indicador
de GFR en la evaluación de
funcionamientorenal en
pacientes con enfermedades
de riñon.

Antecedentes
Estos métodos comprendían el uso de
Método 1

(1) Hexoquinasa, (2)
fosfoglucosa isomerasa,
(3) fosfato de 6-glucosa
deshidrogenasa, (4) ATP,
y (5) alcohol
deshidrogenasa
(NADP+)

Método 2

(1) Fructosadeshidrogenasa, (2)
peroxidasa, (3) 1-metoxy-5metilfenazina, (4) N-etil-N(2-hidroxy-3-sulfopropil)mtoludina,
(5) 4-aminoantipirinaMucho error asociado

K. Hofer, et al. (1999)

S. Kimata, et al. (2009)

Metodología
Proceso quimico:
Detección de Inulina mediante la
hidrólisis de la Inulina a D-fructosa, para
ello se utiliza una solución de Inulinasa
(enzima) y el acido 5-quinolineboronico
que selectivamente acordona la Dfructosa. La adicción de D-fructosa
aumenta la intensidad fluorescente del
acido 5-QBA.

AnálisisFluorimétrico:
Se mide la intensidad de
fluorescencia del compuesto
fluorescente para diferentes
concentraciones de Inulina
(patrones). De esta forma se
obtiene la curva de calibración.

Reactivos:
Solución de Inulinasa, Buffer de fosfato,
Acido 5-quinolineborico (5-QBA), buffer
de acetato.
Ventajas de la metodología propuesta:
El método propuesto es sencillo y selectivamente
obtiene la D-fructosa de laInulina.

Metodología:
Funcionamiento del
fluorímetro
El haz dirigido a la muestra

pasa por un filtro, donde
se selecciona la longitud
de onda de incidencia. Se
excita la muestra
(radiación de excitación)
mediante la absorción de
un fotón de luz,
produciendo la perdida de
energía vibracional al
colisionar con otras
moléculas. La molécula
desciende a otro estado
vibracional emitiendo un
(radiaciónEste es dirigido a un sistema de tubosfotón
y luego
a un emitida).
amplificador , conectado a un sistema de lectura que muestra
la intensidad de la fluorescencia, en alguna escala.

Metodología: Procesos químicos
Proceso químico para muestras de Inulina: 2,5 µL
de una solución de inulinasa se agrega a la solución de
Inulina (50mM buffer de acetato, pH=4,5),
manteniéndose a 50°C para evitar lareacción con
inulinasa. Luego de un tiempo 2,5 mL de una solución
de acido 5-QBA (11µg/mL en 200mM buffer de fosfato,
pH=7,4) es agregado a la solución muestra - La
fluorescencia del acido 5-QBA alcanza su máximo
después de 20 min.
Proceso químico para muestras de plasma bovino:
Similar, aunque las proteínas del plasma (albumina)
interfieren con el acido 5-QBA. Por lo que la
desproteinación por...