Separación de proteínas por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE)

PRÁCTICA 3
Separación de proteínas por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE).


INTRODUCCIÓN
La electroforesis es un proceso por el cual las moléculas cargadas que se encuentran en solución se mueven al aplicarles un campo eléctrico, por lo tanto las moléculas se mueven bajo el efecto de ese campo eléctrico dependiendo de su carga, forma y tamaño. Estatécnica se utilizó inicialmente para separar mezclas de moléculas tanto en soluciones acuosas como dentro de una matriz sólida y porosa; actualmente es uno de los métodos más comunes para el análisis de macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos.

La separación de proteínas en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE) está determinada no solo por la carga eléctrica intrínseca de lospolipéptidos, si no también por su masa molecular y composición. Lo que se persigue con este método es la separación de mezclas de proteínas previamente desnaturalizadas por adición de compuestos como detergentes y agentes reductores, que rompen las estructuras secundaria y terciaria de las mismas quedando una mezcla de polipéptidos con diferente tamaño y carga eléctrica.

El dodecil sulfato desodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas rompiendo las uniones con otras proteínas o lípidos, además las moléculas del detergente se unen a las porciones hidrofóbicas desplegando las cadenas polipeptídicas, por lo tanto el SDS confiere una carga neta negativa a los polipéptidos dependiendo de su longitud y composición. Cuando una mezcla de proteínas es tratada con SDSy un agente reductor como -mercaptoetanol o ditiotreitol (Fig. 1), los polipéptidos quedan rodeados de cargas negativas de manera que se forma una “densidad de carga” o “carga por unidad de longitud”. Si esta mezcla de polipéptidos se hace pasar por una lámina de gel de poliacrilamida aplicándole un campo eléctrico, cada molécula viajará por los poros del gel atraída hacia el polo positivo,tanto como su tamaño lo permita.


Figura 1. Estructura química del dodecil sulfato de sodio y el -mercaptoetanol.

Con la electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida pueden separarse mezclas de hasta cientos de proteínas que, después de un proceso de tinción o revelado se visualizan en el gel como bandas a diferentes alturas de un mismo carril (fig.2). La posición de lasproteínas a lo largo de los carriles, nos dan una aproximación de su tamaño si se comparan con el corrimiento de proteínas de masa molecular conocida, calculando los “Rf”; así también la intensidad de la banda puede ser un indicador de la abundancia relativa de una proteína en particular presente en la muestra.

Figura2. Electroforesis de proteínas en SDS-PAGE.


La capacidad para estimar eltamaño y la cantidad de una proteína proporciona la posibilidad de varias aplicaciones de la SDS-PAGE, como son la estimación de la pureza y nivel de expresión de la proteína, la identificación por inmunodetección de una o varias proteínas de interés, preparación para la secuenciación y /o generación de anticuerpos.

Existen dos tipos de electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamidallamados continuo y discontinuo (Fig.3). En un sistema continuo las proteínas se separan en un solo gel preparado con el mismo amortiguador utilizado para la corrida; en cambio en el discontinuo las proteínas primero se hacen pasar por un gel no restrictivo que posee un tamaño de poro grande, de manera que las proteínas viajan por él rápidamente; debajo de este gel (concentrador) se prepara un gelde concentración de poliacrilamida mas alto (separador), por lo tanto el tamaño del poro es mas pequeño, lo que causa que a esta altura las proteínas viajen mas lentamente. Esta discontinuidad en el gel hace mas eficiente la separación de los polipéptidos de la muestra.


Figura 3. Sistemas continuo y discontinuo en la electroforesis
en geles desnaturalizantes de poliacrilamida....