Separación de una mezcla de dos aminoácidos por cromatografía por intercambio iónico

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS



Separación de una mezcla de dos aminoácidos por cromatografía por intercambio iónico



Profesor: Joaquín Cordero Martínez


Materia: Laboratorio de Métodos de Análisis

Grupo: 4IM1

SECCION 2







Separación de una mezcla de dos aminoácidos por cromatografía por intercambio iónico
ObjetivosEmplear la técnica de intercambio iónico para la separación de dos aminoácidos
Comprobar la separación mediante una reacción colorida y el perfil de elución
Introducción
Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones móviles. Estos contra-iones pueden intercambiarsereversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz.
La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos. Las características de la matriz determinan sus propiedades cromatográficas tales como su eficiencia, capacidad y recuperación, así como su estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez.
La separación en la cromatografía deintercambio iónico depende la adsorción reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico. Él intercambio consta de cinco etapas
La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en las condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá launión de las moléculas de soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarán están asociados con sus respectivos contra-iones.
En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en la cual las moléculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen soneluídas del intercambiador usando el regulador inicial.
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las condiciones de elusión, al desfavorecer la formación del enlace iónico de las moléculas de la muestra. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza iónica del regulador de elusión o cambiando su pH.
En la cuarta y quinta etapa corresponden a la remoción de sustanciano eluídas .

La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen diferentes grados interacción con el intercambiador iónico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza iónica y el pH.

Resultados experimentales
Tabla 1.Registrode absorbancias de la Separación de prolina e histidina
Volumen de elución (ml)
A400
A570
3
0
0.024
6
0
0.001
9
0
0.029
12
0
0
15
0.075
0.047
18
0.375
0.086
21
0.526
0.111
24
0.353
0.11
27
0.241
0.054
30
0.081
0.016
33
0.054
0.048
36
0.015
0.035
39
0
0.028
42
0.032
0.076
45
0.044
0.089
48
0.017
0.073
51
0
0.068
54
0.029
0.089
57
0.1180.133
60
0.06
0.198







Grafica N° 1. Perfil de elución de dos aminoácidos (prolina e histidina)

a) ¿Cuál es el aminoácido que eluyó primero ? prolina
Tenemos que la estructura de la prolina tiene 2 valores de pka los cuales tiene en el grupo carboxilo y en el grupo amino mientras que la histidina tiene 3 valores de pka
Tabla 2.Valores de pka
aminoácido
COOH
NH2+
Grupo RPunto isoeléctrico
Prolina
1.99
10.6
-
6.29
Histidina
1.82
9.17
6.0
7.58

La prolina tiene un punto isoeléctrico de 6.29 por lo que su carga neta es 0 y por lo cual sale primero, la resina es cationica por lo que va a retener a los grupos con carga + de la histidina mientras que la prolina eluye primero.




b) ¿Cuál es la importancia de regular la velocidad de elución, que...