Separacion Pbmc
Páginas: 3 (720 palabras)
Publicado: 26 de octubre de 2011
SEPARACIÓN DE PBMC A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA 1. Abreviaturas utilizadas. • PBMC: células mononucleadas de sangre periférica (“Peripheral Blood
Mononuclear Cells”). • PBRC: células rojas desangre perífica (“Peripheral Blood Red Cells”). • T.A: temperatura ambiente (18-25°C)
2. Materiales. • Sangre venosa periférica (5-10 ml), extraída en heparina de litio o ACD como anticoagulantes.Nota: el tiempo tras la extracción no debe exceder de dos días si se realiza en heparina de litio o cuatro si se realiza en ACD, pues la viabilidad celular de los PBMC puede verse comprometida. Almacenelas muestras siempre a temperatura ambiente.
• Ficoll-Paque Plus® (GE-HealthCare, ref. 17-1440-03). • Leucosep®, tubo Falcon de 50ml con membrana separadora (Greiner Bio-one, ref 227290). • RPMI1640 Medium con glutamina y HEPES (BioWhittaker cat nº BE12-115F). • Suero Bovino Fetal (AbCys S.A. ref. S1820) • Dimetilsufóxido (DMSO) (Sigma ref. D2650). • Pipetas Pasteur estériles de plástico. •Pipetas serológicas graduadas estériles para pipeteador eléctrico. • Puntas estériles con filtro para micropipeta P1000. • Tubos cónicos estériles con tapón a rosca, tipo Falcon, de 50 ml.
Muyimportante: Todas las operaciones descritas a continuación, deben realizarse en condiciones de esterilidad en cabina de flujo laminar.
3. Desarrollo. • Centrifugar el tubo que contiene la sangre a 800xg10 min a T.A.
Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca. Campus Miguel de Unamuno, s/n. 37007 Salamanca. Tlf.: 923 294 833 Fax: 923 294 795 e-mail: bancoadn@usal.es
•Retirar el tapón del tubo de sangre y aspirar suavemente con pipeta Pateur el plasma (interfase superior). No retire todo el plasma pues los PBMC se hallan entre la fase de plasma (amarillenta) y la fase dePBRC (roja). Desechar el plasma. • Traspasar el resto de la sangre hacia un tubo Falcon de 50 ml y completar hasta 20 ml con RPMI 1640. • Homogeneizar el tubo que contiene la sangre-RPMI durante 30...
Mononuclear Cells”). • PBRC: células rojas desangre perífica (“Peripheral Blood Red Cells”). • T.A: temperatura ambiente (18-25°C)
2. Materiales. • Sangre venosa periférica (5-10 ml), extraída en heparina de litio o ACD como anticoagulantes.Nota: el tiempo tras la extracción no debe exceder de dos días si se realiza en heparina de litio o cuatro si se realiza en ACD, pues la viabilidad celular de los PBMC puede verse comprometida. Almacenelas muestras siempre a temperatura ambiente.
• Ficoll-Paque Plus® (GE-HealthCare, ref. 17-1440-03). • Leucosep®, tubo Falcon de 50ml con membrana separadora (Greiner Bio-one, ref 227290). • RPMI1640 Medium con glutamina y HEPES (BioWhittaker cat nº BE12-115F). • Suero Bovino Fetal (AbCys S.A. ref. S1820) • Dimetilsufóxido (DMSO) (Sigma ref. D2650). • Pipetas Pasteur estériles de plástico. •Pipetas serológicas graduadas estériles para pipeteador eléctrico. • Puntas estériles con filtro para micropipeta P1000. • Tubos cónicos estériles con tapón a rosca, tipo Falcon, de 50 ml.
Muyimportante: Todas las operaciones descritas a continuación, deben realizarse en condiciones de esterilidad en cabina de flujo laminar.
3. Desarrollo. • Centrifugar el tubo que contiene la sangre a 800xg10 min a T.A.
Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca. Campus Miguel de Unamuno, s/n. 37007 Salamanca. Tlf.: 923 294 833 Fax: 923 294 795 e-mail: bancoadn@usal.es
•Retirar el tapón del tubo de sangre y aspirar suavemente con pipeta Pateur el plasma (interfase superior). No retire todo el plasma pues los PBMC se hallan entre la fase de plasma (amarillenta) y la fase dePBRC (roja). Desechar el plasma. • Traspasar el resto de la sangre hacia un tubo Falcon de 50 ml y completar hasta 20 ml con RPMI 1640. • Homogeneizar el tubo que contiene la sangre-RPMI durante 30...
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