Sexado De Espermatozoides

Sexaje de Semen

Valor de su Aplicación en Producción Lechera y Porcina

Un poco de Historia
8,000- 6,000 A.C. Comienza la cría de animales Mesopotámica (ovinos), Egipto (bovinos y cabras), China (ponies), Medio Este (camellos), Sudamérica (llamas)

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Determinación del Sexo
Muchos métodos descriptos: •Científicos •Folklóricos •Probabilidad •Similar eficiencia, poca repetibilidad460-370 A.C. Hipócrates es el primero en registrar interés en el control del sexo en las crías.

Anaxágoras • “Los espermatozoides del testículo derecho producen machos y los del izquierdo, hembras” • Atar uno u otro podría determinar el sexo • Fue practicado por los nobles franceses hasta el siglo XVIII

Tiempo de inseminación  no produce efecto (variabilidad de la ovulación) Fases lunaresLavados vaginales ácidos o alcalinos

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1780 Spallanzani realiza la primera I. A. en perras. 1860 Mendel es el primer científico que infiere que las características de las crías pasan directamente de ambos padres de generación en generación.

1910 Comienza la Inseminación Artificial Hoy se inseminan más del 65% de las vacas lecheras de USA, el 85% del Reino Unido, y el 90% de Escandinava.1950s Semen Congelado Hoy el 99% de la inseminación artificial en la industria lechera de USA y el Reino Unido usan semen congelado.

1970s Citómetro de Flujo. Se desarrolla el primer equipo para separar células vivas a gran velocidad.

Fines de 1980s Separación de Espermatozoides X e Y (pero no son viables).

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Generalidades
El espermatozoide determina el sexo de las crías en losmamíferos La mitad de los espermatozoides portan cromosoma X y la mitad Y Se estima un 50% de nacimientos por cada sexo Objetivo: modificar esa proporción

Sistema de sexado exitoso: •rápido •confiable •barato •no disminuir la viabilidad de las células

Posibilidades: •Sexado de semen •Determinación de sexo después de la TE •Determinación de sexo antes de la TE

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Determinación del sexodespués de la TE
•Transferencia de embriones biseccionados •Ecografía •Análisis cromosómico •PCR de sangre materna (ADN del gen Sry)

Determinación del sexo antes de TE
•Southernblot (biopsia de 10 células, tarda una semana) (sondas para secuencias del Y) •PCR (biopsia de varias células y tarda días) •FISH, biopsia de 1 célula y tarda horas, se evita la contaminación por otros ADN •Velocidaddiferencial en el desarrollo embrionario y cuantificación de diferencias metabólicas entre sexos

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Sexado de Semen
Actualidad: dos sistemas exitosos Citometría de Flujo con Análisis Computarizado (CIFAC) Separación Espermática con Anticuerpos Monoclonales (SEAM)

Sexado de Semen

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Diferencias en ADN entre espermatozoides X e Y
Especie Pavo Hombre Cerdo Caballo Toro Perro MoruecoChinchilla Diferencia (%) 0 2,8 3,6 3,7 3,8 3,9 4,2 7,5

Algunos Métodos de Sexado
•Columnas de Albúmina •Convección térmica contracorriente •Citometría de flujo •Filtración por Sephadex •Cantidad de LDHC4 •Percoll-Ficoll •Electroforesis •Antígeno H-Y

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Velocidad media en subpoblaciones espermáticas

Procedimiento para separar espermatozoides por citometría de flujo
• El espermatozoidede toro que contiene el cromosoma X tiene 3.8% más ADN que el que contiene el cromosoma Y • Se tiñen espermatozoides frescos por 45 minutos con Hoechst 33342, que se une al ADN cuantitativamente

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• El espermatozoide X produce 3.8% más fluorescencia azul cuando es expuesto a un láser de cierta longitud de onda • El semen se separa razón de 90,000 gotas/segundo con un espermatozoide c/u,pasando a través de una boquilla muy fina a 100 Km./h • Los X se cargan positivamente y los Y negativamente • Los espermatozoides muertos y aquellos que no han podido ser sexados no son cargados

Los espermatozoides corren a través de placas cargadas, los Y son atraídos a la placa positiva, los X a la negativa, y las gotas sin carga son descartadas

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Citometría de flujo

Gledhill 1988...