Si Hacer Nada

Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Iztacala

Biología

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA MALATO DESHIDROGENASA

Aldaba Núñez Fabian Augusto
hernández mendoza maría del carmen
machorro tirado maria de los angeles
molina ortega madeline getzemany

Equipo IV

Grupo 2251

Tlalnepantla de Baz, México a 19 de Abril del 2012
Introducción
El nombrecomún de una enzima termina en deshidrogenasa cuando los aceptores son coenzimas o colorantes de oxidación/reducción. Estas enzimas son llamadas frecuentemente deshidrogenasas anaerobias porque pueden funcionar en ausencia de oxigeno siempre que haya disponible suficiente cantidad de aceptor (coenzima). Las deshidrogenasas son enzimas proteínicas conjugadas que poseen actividad oxidante por lapresencia en ellas de grupos prostéticos como NAD+, NADP+, FMN y FAD (Mazur y Harrow, 1973).
La enzima malato deshidrogenasa (MDH) cataliza la reacción de oxidación del (S)-malato a oxalacetato utilizando NAD+ como aceptor de electrones (cofactor) y es específica para la L-malato, aunque también oxida otros ácidos 2-hidrocarboxílicos (Smith y Wood, 1997; De Roberts, 2005).
S-malato + NAD+Oxalacetato+NADH
La MDH participa en el ciclo del ácido cítrico y existen todos los organismos aerobios; mientras que los organismos procariotas tienen una sola forma de MDH en las células eucariotas hay dos isozimas: una de ellas localizada en la matriz mitocondrial y otra en el citoplasma; los hongos y las plantas también tienen una forma glioxisomal que es usada en la ruta del glioxilato. En loscloroplastos de las plantas hay una forma adicional de MDH dependiente del NADP, malato deshidrogenasa (NADP+), que es esencial para la fotosíntesis universal C3, ciclo de Calvin, y para la ruta C4 más especializada (Hortonet al., 1995; Melo y Cuamatzi, 2006).
Esta enzima reacciona con el lado A del anillo nicotinamida de NAD+. La Keq=1.3x10-5 indica que favorece la formación de malato en vez deoxalacetato, la separación de este por reacción con acetil-CoA para formar citrato lleva la reacción hacia la dirección de la reacción directa (Mazur y Harrow, 1973).

Oxidación del grupo hidroxilo del L-malato a una cetona en una reacción dependiente de NAD+.
A bajas concentraciones de sustrato la velocidad inicial es proporcional a dicha concentración. Cuando la concentración de sustrato esmuy elevada, la velocidad de reacción se aproxima a un límite superior conocido como velocidad máxima (Vmax). El parámetro Km se denomina constante de Michaelis-Menten y es la concentración de sustrato a la cual la enzima funciona a la mitad de su velocidad máxima (Nelson y Cox, 2001).
El curso de una reacción que comprende la reducción o la oxidación de NAD+ o NADP+ puede seguirse espectrofotométricamente por la diferencia entre los espectros de absorción de las formas oxidada y reducida a 340 mµ. La forma reducida tiene absorción intensa a esta longitud de onda, mientras la forma oxidada tiene poca absorción (Mazur y Harrow, 1973).
Para cuantificar proteínas el método Bradford es muy utilizado debido a su facilidad, éste emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosasen presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente (Smith y Wood, 1997).
Metodología
Primero se prepara el extracto crudo pesando 1g de germinado y se lava con agua destilada, se corta en fragmentos pequeños y se homogenizan en un mortero frío con 5 ml de mediode homogenización, se recupere el homogenizado en cuatro tubos de micro centrífuga sin arrastrar pedazos de tejido y se mantienen en hielo. Se centrifuga 5 min a 14,000 rpm, se recupera el sobrenadante en un tubo de ensayo y se mantiene en hielo.
Para el ensayo enzimático sustrato vs velocidad se preparan los tubos con las soluciones indicadas:
| | | | Tubo | | | |
Reactivo | 1 | 2 |...