Sintesis de proteinas

Práctica de Plásmidos
Material
• Gel de Agarosa al 1% de Bromuro de Etidio.
• Tubos eppendorf, micropipetas, puntas esteriles.
• Microcentrifuga.
• Camara de Electroforesis horizontal.
•Célula E. Coli transformadas. Suspensión en medio LB/Amp.
• Solución de resuspension (Buffer 1) 50m/M Tris HCL, 10mm.
• Solucion de Lisis (Buffer) 200 ml Na OH, 1%, SDS.
• Soucion 3M de acetato dePotasio (Buffer 3).
• Etanol.
Procedimiento
1- Se forma 1ml de cultivo de bacterias, se centrifuga en un tubo, Eppendorf durante 2 min (14,000 um). Se elimina el sobrenadante por inmersión del tuboeppendorf.
2- Se re suspende la pastilla de bacterias en 100 um de Buffer, se incuba 2 minutos a temperatura ambiente.
3- Se añaden al tubo 200ml de Buffer, se agita por inversión suave y se incubadurante 5 minutos a temperatura ambiente.
4- Se añaden 150 um de Buffer 3 y se mezcla el contenido del tubo (observar el aspecto del tubo, aparecerá una turbidez blanca al precipitar proteínas y el DNAcromosómico). Se incuba 5 minutos en hielo.
5- Se centrifuga 5 minutos (14 mil revoluciones por minuto)
6- Con ayuda de una pipeta se transfiere cuidadosamente a fase acuosa (sobrenadante a un tuboeppendorf)
7- En este sobrenadante se encuentra RNA y DNA plásmidico. Estos ácidos nucleicos se precipitan en 500 um de etanol absoluto frio. Mezclar bien por inversión.
8- Centrifugar durante 5minutos a 14 mil revoluciones por minuto (Rpm)
9- Se elimina todo el sobrenadante por inversión con cuidado. El precipitado se lava de nuevo con 500 um de etanol frio al 70%.
10- Se elimina todo elsobrenadante por inversión. El precipitado casi invisible que contiene DNA plásmídico.

INTRODUCCIÓN
Los plásmidos son estructuras circulares cerradas de DNA que están presentes en las bacterias y enocasiones en células de eucariontes. Contienen secuencias que sirven como sitio de origen de la replicación, lo que le permite replicarse de manera autónoma. Presentan un tamaño que se oscila de 1...