Sobre Plasmidos
Páginas: 6 (1398 palabras)
Publicado: 15 de diciembre de 2012
9.2.2 Enzimas de restricción y ligamento del ADN en vitro
Una enzima de restricción (o endonucleasas de Restricción) es una enzima que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto llamado sitio o diana de restricción o en un sitio no muy lejano a este, dependiendo de la enzima. Los sitios de restriccióncuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.
El mecanismo de corte de DNA se realiza a través del rompimiento de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, dando lugar a dos extremos de DNA, que pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo ya que los extremos se pueden unir aotros extremos coincidentes que puedan haber en la cercanía (Apareamiento de Watson & Crick).
Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo de vectores están los Plásmidos moléculascirculares de ADN halladas en las bacterias.
Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas Isoesquizómeros. Por ejemplo, están los Isoesquizómeros Asp 718 y Kpn1.
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a losMicrobiólogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las Endonucleasas de Restricción, conduciendo al desarrollo de la tecnología de ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.
Uno de los campos en los que el uso de Enzimas de Restricción ha tenido mayor implicancia hasido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas a cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de trozos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la Enzima de Restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte, con lo que al aplicar ésta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observardistintas cantidades de trozos para cada caso en una electroforesis
[pic]
Enzima de Restricción EcoRI unida al ADN
Sistemas de Restricción-Modificación (M-R)
El sistema de restricción-modificación (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos que ingresen a la bacteria, distinguiendolo del ADN propio, análogo a un sistema inmune. El ADN propio no esreconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-Adenosil-Metionina (SAM) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infección del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas“K12” y “B”). Este sistema consta de dos partes:
Restricción: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exógenos para evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a través de cortes mediante endonucleasas derestricción a los DNA exogenos que ingresen a la bacteria.
Modificación: Consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa específica.
Existen varios mecanismos de acción generales de estos sistemas, de los cuales se destaca el Tipo I y el tipo II:
M-R tipo I: Fueron los primeros en...
Una enzima de restricción (o endonucleasas de Restricción) es una enzima que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto llamado sitio o diana de restricción o en un sitio no muy lejano a este, dependiendo de la enzima. Los sitios de restriccióncuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.
El mecanismo de corte de DNA se realiza a través del rompimiento de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, dando lugar a dos extremos de DNA, que pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo ya que los extremos se pueden unir aotros extremos coincidentes que puedan haber en la cercanía (Apareamiento de Watson & Crick).
Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo de vectores están los Plásmidos moléculascirculares de ADN halladas en las bacterias.
Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas Isoesquizómeros. Por ejemplo, están los Isoesquizómeros Asp 718 y Kpn1.
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a losMicrobiólogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las Endonucleasas de Restricción, conduciendo al desarrollo de la tecnología de ADN recombinante. El primer uso práctico de su trabajo fue la manipulación de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabéticos.
Uno de los campos en los que el uso de Enzimas de Restricción ha tenido mayor implicancia hasido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas a cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de trozos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la Enzima de Restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte, con lo que al aplicar ésta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberían observardistintas cantidades de trozos para cada caso en una electroforesis
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Enzima de Restricción EcoRI unida al ADN
Sistemas de Restricción-Modificación (M-R)
El sistema de restricción-modificación (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos que ingresen a la bacteria, distinguiendolo del ADN propio, análogo a un sistema inmune. El ADN propio no esreconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-Adenosil-Metionina (SAM) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infección del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas“K12” y “B”). Este sistema consta de dos partes:
Restricción: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exógenos para evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a través de cortes mediante endonucleasas derestricción a los DNA exogenos que ingresen a la bacteria.
Modificación: Consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa específica.
Existen varios mecanismos de acción generales de estos sistemas, de los cuales se destaca el Tipo I y el tipo II:
M-R tipo I: Fueron los primeros en...
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