sodimel

1. OBJETIVO

Método espectrofotométrico para determinar la actividad de SOD de GliSODin®

2. DEFINICIÓN

- SOD: Superóxido dismutasa

- Unidad de SOD: Una unidad de SOD se define como la cantidad de SOD requerida para inhibir la tasa de reducción de NBT en un 50%.

3. PRINCIPIO

Este procedimiento se basa en el método publicado en Journal of Pharmaceutical Analysis andBiomedical: “Raw material enzymatic activity determination: A specific case for validation and comparison of analytical methods – The example of superoxide dismutase (SOD)” [Jiang Yan Zhou, Patrice Prognon, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis; 2006, vol. 40, no5, pp. 1143-1148].

La actividad de SOD se analizó usando un estándar colorimétrico en el que un sistema de xantina/xantina-oxidasasirve como un generador de radicales libres y provoca la reducción de nitro azul tetrazolio (NBT) a un colorante azul de formazán. El NBT reducido se puede analizar mediante la absorbancia a 560 nm. SOD inhibe la reducción de NBT por barrido de los radicales libres generados por el sistema xantina/xantina-oxidasa.

4. REACTIVOS

4.1 Xantina (Sigma X0626), ≥99.5% (HPLC), se purificó porrecristalización. Almacenar en lugar fresco.

4.2 La xantina oxidasa a partir de leche bovina (Sigma X 4500), grado III, suspensión de sulfato de amonio. Almacenar entre 2 y 8 ° C

4.3 Cloruro de nitroazul de tetrazolio (Sigma, ref N-6876): sensible a la luz.

4.4 Ácido dietilentriaminopentaacético (Sigma D 6518), ≥99.0% (HPLC). Almacenar en un lugar fresco.

4.5 Hidróxido de potasio 0,1 N(Prolabo, ref VWR 31.780,298), almacenar en un lugar fresco.

4.6 Fosfato de potasio dihidrógeno (Prolabo, ref. VWR 26.925,295), ≥99.0%.

4.7 Di-fosfato de potasio hidrógeno (Prolabo, ref. VWR 26.930,293), ≥97.0%.


5. APARATOS Y PARÁMETROS

5.1 Espectrofotómetro Cary modelo 100 equipado con un compartimiento de la celda Peltier termostatizado.

5.2 Macro-Cuvette, PMMA, capacidad de2.5 a 4.5 ml (PLASTIBRAND® ref. 7591 05).

5.3 Agitador magnético para celda

5.4 Pipeta automática 50-1000 l (de Eppendorf o equivalente)

6. PROCEDIMIENTO

6.1 Preparación de las soluciones

Tampón de fosfato de Potasio 0,05 M pH = 7,8.
En recipientes adecuados, preparar por separado 6,805 g / L (0,05 M) de solución de KH2PO4 (4,6) y un 8,709 g / L
Solución (0,05 M) de K2HPO4(4,7).
Añadir la solución de KH2PO4 a la solución de K2HPO4.
El para el valor de pH debe ser 7,8.
Almacene todas las soluciones entre 2 y 8 ° C.

Solución 1,61 mM xantina.
En un matraz aforado de 50 ml, pesar con precisión, 12,24 mg de la xantina (4.1). Añadir agua purificada para un volumen de aproximadamente 30 ml.

Sonicar durante 1 minuto.
Añadir KOH 0,1 N (4.5) hasta disolucióncompleta (aproximadamente 1 ml) y diluir hasta 50 ml con agua purificada. Mezclar y etiquetar adecuadamente.

Solución 1,96 mM NBT.
En un matraz aforado de 10 ml, pesar con precisión, 16.03 mg de NBT (4.3).
Diluir hasta 10 ml con tampón fosfato 0,05 M. Mezcle y etiquete adecuadamente.
Proteger de la luz directa.

Solución 1,24 mM DETAPAC.
En un matraz aforado de 100 ml, pesar conprecisión, 48.78 mg de DETAPAC (4.4).
Diluir hasta 100 ml con tampón fosfato 0,05 M. Mezcle y etiquete adecuadamente.

Cóctel de reactivos: (REACT) .
En un matraz aforado de 50 ml, añadir: 1,5 ml de solución de NBT y 5,0 ml de solución de xantina. Diluir hasta 50 ml con solución DETAPAC. Proteger de la luz directa.

Solución GliSODin®: (GLI) .
En un vial de vidrio de 25 ml, pesar con precisión1,00 g de polvo de GliSODin®. Añadir 7 ml de agua purificada. Agite en vortex durante 2 minutos. Sonicar durante 15 minutos. Centrifugar a 1600 rpm durante 20 minutos entre 5 a 10 ° C. Transferir la parte clara a un matraz volumétrico de 10 ml marrón y diluir hasta volumen con agua purificada. Mezclar.
6.2 GliSODin® diluciones de soluciones: dil GLI.


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