solubilizacion y precipitacion

Ultracentrifugación

La centrifugación diferencial es un procedimiento común en microbiología y citología, usado para separar ciertos orgánulos de su respectiva célula para un análisis posterior de partes específicas de las células. En el proceso, primero se homogeniza una muestra de tejido para romper las membranas celulares y mezclar los contenidos de las células. Luego, esta mezclahomogéneaes sometida a repetidas centrifugaciones, cada vez removiendo el precipitado, e incrementando la fuerza centrífuga. Finalmente, la purificación debe ser hecha por la sedimentación de equilibrio, y la capa deseada es extraída para un futuro análisis.

La separación está basada en el tamaño y la densidad, donde las partículas más grandes y densas son precipitadas en centrifugaciones de pocafuerza. Por ejemplo, las células completas no homogenizadas serán precipitadas en centrifugaciones con poca fuerza y en cortos intervalos como 1,000g por 5 minutos. Los fragmentos más pequeños de las células y los orgánulos permanecen en el líquido sobrenadante y requieren más fuerza centrífuga y más tiempo para precipitarse. En general, uno puede enriquecer (separar o concentrar) los siguientescomponentes de la célula, en orden de separación, con la presente aplicación:

Células completas y núcleos;
Mitocondria, lisosomas y peroxisomas;
Microsomas (vesículas del retículo endoplasmático); y
Ribosomas y citosoles.

Índice

1 Preparación de la muestra
2 Ultracentrifugación
3 Técnicas
3.1 Centrifugación por gradiente de equilibrio
3.2Sedimentación de equilibrio de densidades (Sedimentación Isopícnica)
3.3 Centrifugación por gradiente de sacarosa
4 Referencias

Preparación de la muestra

Antes de que la centrifugación diferencial pueda ser llevada a cabo para separar diferentes porciones de la célula de otras porciones, el tejido de muestra debe ser homogenizado. En este proceso, son usadas una licuadora y una piezade porcelana porosa de la misma forma y dimensión que el contenedor. El contenedor es, en la mayoría de los casos, un tubo de ebullición de vidrio.

Primero, el tejido de muestra es triturado y una solución amortiguadora le es añadida, formando una suspensión líquida de tejido de muestra triturado. La solución amortiguadora es una solución acuosa, densa e inerte, que es diseñada para suspenderla muestra en un medio líquido sin dañarla por reacciones químicas u osmóticas. En la mayoría de los casos, la solución usada es de sacarosa, en otros, es usada una solución de salmuera. Luego, la licuadora, conectada a un rotor de alta velocidad, es insertada en el contenedor que lleva la muestra, presionando la muestra de tejido triturado contra las paredes del contenedor.

Con el rotorencendido, la muestra de tejido es molida en pequeños fragmentos por los poros de la porcelana y las paredes del contenedor. Este proceso de molimiento romperá las membranas celulares de las células en el tejido de muestra, dejando orgánulos individuales suspendidos en la solución. Este proceso es llamado homogenización. Una porción de células permanecerán intactas después de moler la muestra, y algunosorgánulos serán afectados, y de estos, se encargarán las próximas etapas de centrifugación.
Ultracentrifugación

La muestra homogeneizada ahora esta lista para la centrifugación en una ultracentrifugadora. Una ultracentrifugadora consiste en una cámara al vacío y refrigerada que contiene un rotor, el cual es manejado por un motor eléctrico capaz de girar a alta velocidad. Las muestras sonubicadas en tubos que se encuentran dentro del rotor o sujetos a este. La velocidad rotacional puede alcanzar más de 100.000 rpm para el modelo “floor”, 150.000 rpm para el modelo “bench-top” (Beckman Optima Max-XP), generando fuerzas centrifugas entre 800.000g y 1.000.000g. Esta fuerza causa la sedimentación de macromoléculas e incluso puede causar una distribución no uniforme de moléculas...